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1、腹腔镜与开腹胆囊切除术对腹腔免疫功能影响的比较 作者：于建军，陆国超，李春雨，吴远冰【关键词】 ,腹腔镜摘 要：目的：比较腹腔镜与开腹胆囊手术对腹腔局部免疫功能的影响。方法：检测一组31例腹腔镜胆囊切除术患者(A组)和一组33例开腹胆囊切除术患者(B组)腹腔内渗液pH 值、腹腔中性粒细胞吞噬功能、巨噬细胞产生TNF生物学活性、腹腔T细胞亚群CD4+/CD8+的比值，并采用T检验比较两组各项指标的差异。结果：A组和B组腹腔pH 值分别为7.13和7.39；中性粒细胞化学发光峰值为分别为98和102；L929细胞OD570值分别为0.183和0.152；CD4+/CD8+比值分别为0.53和0.5
2、7。除CD4+/CD8+比值外，其余三项指标的差异均有显著性。结论：与开腹胆囊切除术比较，腹腔镜胆囊切除术对腹腔局部免疫特别是细胞免疫有明显的抑制效应。此种免疫抑制效应源于CO2气腹所引起的局部内环境的酸性化，对巨噬细胞功能的影响犹为显著。胆囊有急性炎症者应慎行腹腔镜胆囊切除术。关键词：胆囊切除术；氢离子浓度；白细胞吞噬；肿瘤坏死因子；T淋巴细胞亚群Compare the Influence of Laparoscopic and Open Cholecystectomy on the Immune Function of the Local Peritoneal CavityAbstract
3、： Objective： To compare the influence of laparoscopic and open cholecystectomy on the immune function of the local peritoneal cavity. Method： Determination of the pH value , phagocytic function of neutrophils , the biological viability of TNF produced by macrophages and the T lymphocytes subsets CD4
4、+/CD8+ ratio of the peritoneal cavity in a group of 31 cases who underwent laparoscopic cholecystectomy and in another group of 33 cases who underwent open cholecystectomy. We used T test to compare the difference of these 4 indexes between both groups. Result： Of these two groups, the average pH va
5、lue were 7.13 and 7.39 respectively; The mean peak value of chemiluminescence was 98 and 102 respectively; the mean OD570 of L929 Cells was 0.183 and 0.152 respectively; and the CD4+/CD8+ ratio was 0.53 and 0.57 respectively. Except for the CD4+/CD8+ ratio, the difference of the other 3 indexes betw
6、een both groups were of significance. Conclusion： Compared to open surgery, laparoscopic cholecystectomy has obvious depressive effects on the immune functions particularly cell-mediated immune function of the local peritoneal cavity. Such immune depressive effects originate from the acidification o
7、f the intra peritoneal environment caused by CO2 pneumoperitoneum, and are more evident on macrophages. Therefore, laparoscopic cholecystectomy on patients with acute inflammation of the gallbladder should be very cautious. Key words： Cholecystectomy; Hydrogenion concentration; Neutrophil phagocytic
8、; Tumor necrosis factor ; T lymphocytes subset尽管腹腔镜手术对全身免疫功能影响较小已是定论，腹腔镜手术对腹腔免疫功能的影响目前仍未明确。自2005年4月至2005年11月，我们在收治的腹腔镜胆囊切除术患者和开腹胆囊切除术患者中检测并比较两者的腹腔免疫功能，现报告如下。1 资料与方法1.1 一般资料：腹腔镜胆囊切除术组(A组)共31例，男8例，女23例，年龄2262岁，平均41岁。胆囊结石23例，胆囊息肉3例，慢性胆囊炎2例，萎缩性胆囊炎3例。采用CO2气腹，压力1214 mmHg。手术时间3560 min ,平均42 min。本组病例无中转开腹。开
9、腹胆囊切除术组共33例(B组)，男12例，女21例，年龄2168岁，平均42岁。胆囊结石24例，胆囊息肉4例，慢性胆囊炎3例，萎缩性胆囊炎2例。本组手术时间4080min，平均60min。两组患者均无脏器损伤或胆漏等并发症。1.2 方法1.2.1 腹腔液pH值的测定: pH值测定采用ABL-3型血气分析仪（丹麦产）,关腹或关闭CO2气腹前测定腹腔渗液pH值。1.2.2 腹腔液的获取：两组患者均于手术结束关腹或关闭CO2气腹前，于腹腔液PH值测定后，以50ml冷生理盐水冲洗腹腔内无血液污染处，2min后收集灌洗液作进一步分析之用。1.2.3 中性粒细胞和巨噬细胞的分离:腹腔灌洗液经葡聚糖沉降和淋
10、巴细胞分离液离心分离二步方法获得中性粒细胞悬液(经低渗液除去红细胞) ，台酚兰法检测中性粒细胞活性为95%以上。500g离心腹腔灌洗液7分钟沉淀细胞后弃去上清，重新悬浮沉淀于1ml含抗生素和10%胎牛血清的RPMI溶液中。将细胞接种于一个六孔板并稀释细胞悬浮液，使细胞终浓度为1×106每孔。台盼蓝法测得所有的巨噬细胞活力大于95%。1.2.4 中性粒细胞吞噬功能测定:采用发光剂鲁米诺法测定中性粒细胞吞噬功能。 中性粒细胞悬液混匀置5% CO2培养箱37, 60min, 取悬液0.1ml (5×106 cells每ml), 血浆活化酵母多糖(ZA S) 0.2ml (10mg
11、/ml) 和鲁米诺0.7ml(104M)置测定管中。用LKB 1250发光仪(Luminometer, Finland)测定出化学发光峰值，单位为V/mv，重复3次。峰值降低则表明吞噬功能受损。1.2.5 TNF-生物学活性检测：将分离所得巨噬细胞置于37°C5%CO2培养4h以使细胞贴壁。以PBS洗涤两次。加入含脂多糖（LPS; E Coli:B4, Sigma; 终浓度2g/ml）的RPMI溶液，37°C培养过夜后收集上清，离心除去细胞碎片，存于70°C备用。胰酶消化L929细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。于96 孔培养板每孔接种100l细胞悬
12、液, 375%CO2 培养4h使细胞贴壁。每孔加入100l 4倍稀释的上清液，并置阴性对照。于37 5 %CO2 孵育24h后每孔各加50l MTT,继续培养4h后弃上清，每孔各加150l DMSO ,即在酶标自动分析仪570nm 波长下读取OD值。OD值越高则L929细胞生长抑制越轻，TNF生物学活性越低。1.2.6 T淋巴细胞亚群检测：取EDTA抗凝处理后的腹腔灌洗液2 ml，新鲜标本6h内染色处理。采用CD4 FITC/ CD8 PE抗体(购自美国BD公司) 。每100l样本加10l标记抗体，室温暗处反应20 min 后,加入1 ×FACS 溶血素(购自美国BD公司) 2ml
13、，室温暗处反应10 min,。1000g离心10min，弃上清，加PBS 2ml，1000g离心10min，弃上清，加500l 1%多聚甲醛固定，24h 内上流式细胞仪分析。记录CD4+细胞数，CD8+细胞数，以及CD4+/CD8+比值。1.3 统计学方法：采用SPSS12.0统计本研究所获得的数据，检验方法采用两组独立变量之间的T检验进行统计检验，以P=0.05为显著性检验水平。2 结 果2.1 两组的PH值比较：A组患者的腹腔渗液PH值平均为7.13，显著低于B组的7.39，P<0.01。2.2 两组中性粒细胞吞噬功能：A组患者的中性粒细胞吞噬功能由化学发光法测定，平均发光峰
14、值为98，显著低于B组的102，p<0.01。2.3 巨噬细胞TNF活性比较：巨噬细胞TNF活性由L929细胞法测定。A组患者的OD值平均为0.183，显著高于了B组的0.152，p<0.06。2.4 淋巴细胞亚群比较：A组的T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值为0.53，略低于B组的0.57，但差异没有显著性，p>0.05。详细结果列于表1中。表1 两组患者各项指标比较（略）3 讨 论 一般认为，腹腔镜手术相对于开腹手术而言，对机体的创伤应激较小，对全身的免疫抑制较轻，术后病人恢复快。但CO2气腹对腹膜免疫功能是否有影响还存在争论。目前的研究动物模型
15、较多，临床研究较少，结论也不尽一致。我们通过测定并对比腹腔镜和开腹胆囊切除术两组病人的腹腔细胞免疫功能，得到了比较明确的结论。机体的细胞免疫，主要由粒细胞，T淋巴细胞，单核-巨噬细胞构成。中性粒细胞的吞噬功能是防御感染的主要屏障，T淋巴细胞，巨噬细胞等在肿瘤免疫中发挥着重要的作用。单核-巨噬细胞分泌的TNF，不但对肿瘤有细胞毒作用，而且与其他细胞因子一起形成复杂的免疫网络，对于机体的免疫功能有着相当重要的作用1。用TNF敏感的L929细胞来测定巨噬细胞产生TNF的活性，可以反映出巨噬细胞的功能是否受损。动物模型研究表明，CO2气腹可使腹腔内PH值显著下降，并降低巨噬细胞产生的TNF的量，而氦气
16、气腹组没有类似结果，证实酸性化的内环境对巨噬细胞的功能有明显的损害2，长时间的CO2气腹可能会增加切口肿瘤播散的机会3。本研究的结果与此相一致，腹腔镜手术组腹腔内PH值明显低于开腹手术组。与开腹手术相比，腹腔镜手术明显损害了腹膜中性粒细胞的吞噬功能以及巨噬细胞产生TNF的活性，削弱了腹膜局部的免疫功能。CO2气腹的建立可造成CD4+T淋巴细胞亚群下降、CD8 +亚群不变或轻度下降, CD4 + /CD8 +比值下降，CD8 +相对过多造成免疫抑制。同时CO2 对T淋巴细胞活性有抑制作用，气腹产生的高碳酸血症对T淋巴细胞也有毒性作用4。CD4+/CD8+在腹膜中原本是倒置的5，虽然我们的结果是两
17、组的比值差异没有显著性，但腹腔镜手术组的比值偏低，提示对腹腔T淋巴细胞可能有潜在的影响，有损害其功能的倾向。本研究的结果肯定了腹腔镜胆囊切除术对腹腔局部免疫特别是细胞免疫有明显的抑制效应。此种免疫抑制效应源于CO2气腹所引起的局部内环境的酸性化，对巨噬细胞功能的影响尤为显著，对中性粒细胞及T淋巴细胞的功能也有一定程度的影响。虽然对患者的全身免疫影响较开腹手术小，但局部免疫功能的受损绝不能被忽视。其它类型气腹如氦气或氮气虽能避免腹腔内环境的酸性化，但临床应用仍有待于进一步的研究验证。因此，对于胆囊有急性炎症的患者应慎行腹腔镜手术，以免腹腔局部免疫功能受损而致炎症扩散。参考文献：1Liu Z G.
18、 Molecular mechanism of TNF signaling and beyond. Cell Res, 2005, 15(1):24-27.2Neuhaus SJ, Watson DI, Ellis T, et al. Influence of gases on intraperitoneal immunity during laparoscopy in tumor-bearing rats. World Surg, 2000, 24(10):1227-1231.3Hajri A, Mutter D, Wack S, et al. Dual Effect of Laparosc
19、opy on Cell-Mediated Immunity. Eur Surg Res, 2000, 32:261-266.4胡建昆, 周总光, 陈志新. 腹腔镜结直肠癌手术对机体免疫功能的影响. 中华胃肠外科杂志, 2004,7(3):242-243.5Evrard S, Falkenrodt A, Park A, et al. Influence of CO2 pneumoperitoneum on systemic and peritoneal cell-mediated immunity. World Surg, 1997, 21(4): 353-357.10 / 10文档可自由编辑打印