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1、,细菌分类鉴定的实验室技术发展,（一）细菌分类鉴定的指标,1.传统指标2.分子生物学指标,1.生物分类的传统指标,形态特征群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等；个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等。,从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。,生理生化反应营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等；酶：产酶种类和反应特性等；代谢产物：种类，产量，显色反应等。,生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等；生活史特点：在生活史中出现的菌体变化特点及其规律性；血清学反应：利用抗原构造上的差别进行鉴定；噬菌体的敏
2、感性；其他,2.生物分类的分子生物学指标,DNARNA,按照标准进行传统的生化反应鉴定,标准化成品鉴定产品（如：API试剂条）,半自动细菌鉴定仪（如：ATB Expression）,色谱、光谱分析技术,分子生物学技术,1.生理生化检测技术2.色谱、光谱分析技术3.分子生物学技术,（二）细菌分类鉴定的实验室技术,人工鉴定,培养基的微量化、标准化和商品化,数码分类鉴定技术（生化反应的数字化）,自动化鉴定技术（生物信息的电脑化）细菌的鉴定和药敏试验都实现了自动化,1.生理生化检测技术,前期准备,增菌,划线分离,染色镜检,血清,手工细菌鉴定,手工鉴定流程,1） 临床常见菌的初步分群双岐索引鉴定 例如：
3、葡萄球菌属双岐索引鉴定,早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。 目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。,2）数码鉴定法,数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码,建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（
4、编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。 其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。,数码鉴定法基本原理,微量生化反应系统Micro-ID系统, + + + + + + + ,0 2 0 0 2 1 4 0 0 0 2 1 4 0 0,2 3 4 3 4,相加所得数字：23434 查出相应细菌为：大肠埃希菌,项目分值,数码鉴定法基本原理,先将细菌分离纯化。 做染色形态观察、氧化酶、糖发酵试验。 根据染色、氧化酶、糖发酵试验结果选择不同的生化反应板进行接种（同一个鉴定系统，配有不同细菌的生化反应板）。 培养后，读取生化反应结果，得到一组数据。 将这组数据查编
5、码本（即数据库），即得到鉴定结果。,实验方法：,数码鉴定法基本原理,3）自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统,细菌数码分类技术是细菌自动化鉴定技术的基础，细菌鉴定自动化是把生化反应数字化技术进一步电脑化，数据库用电脑管理，结果用电脑分析和鉴定。 鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。 大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。,对标本同时进行鉴定与药敏测试,全自
6、动细菌鉴定/药敏检测系统,检测流程,纯培养新鲜平板上挑取菌落,制成标准浊度（0.50.6麦氏单位）的菌悬液,菌液加入肉汤中，倒入检测板，上机检测。,检测流程,扫描板条，输入资料，等待鉴定结果。,检测流程,挑选菌落,样品制备于样品盘上,菌种鉴定结果,MALDI BioTyper软件-数据库分析,获取质谱指纹信号,以蛋白为基础的分析方法(Protein based approach),1.样品制备,2.质谱信号,3.菌种鉴定,2.质谱分析的细菌鉴定流程,直接涂抹法 (Direct Transfer ),单一菌种 (Pure culture),涂抹单一菌落于样品盘上(Single colony on
7、 MALDI )Target,加上 1 ml 基质溶液(Overlay with 1 ml HCCA Matrix),90-95% 以上的常规样品可于此制备法得到鉴定结果,步骤 1：样品制备,质谱图:多数为核糖体蛋白(ribosomal proteins) 信号,大肠杆菌 (E.coli),步骤 2：采集谱图,Calculation of a matching score based on:Rel Score% matches of the reference spectrum(e.g. 6 / 10 = 0.6)Rel P-Num.% matches of the unknown spect
8、rum(e.g. 6 / 20 = 0.3)I-Corr.value of intensity correlation,Unknown microorganism is matched against each Main spectrum in biotyper library. Ranking according to matching score, threshold for ID,MSP: Main Spectrum Peaks,步骤 3：数据库比对,Result Report | Detected Species | Ranking |act Sc |max Sc |Rel Score
9、 |PN k |PN b |PN m |Rel P-Num.|I-Corr.|1000*Pro-Spectrum #12 | Ps. mendocina DSM50017 | 1 | 3813 | 4271 | 0.89 | 41 | 10 | 83 | 0.55 | 0.88 | 438 | Ps. oleovorans B396 | 2 | 1671 | 3450 | 0.48 | 14 | 8 | 83 | 0.22 | 0.39 | 41 | Ps. fluoreszens B340 | 3 | 868 | 4186 | 0.21 | 6 | 7 | 83 | 0.11 | 0.19
10、| 4 | Ps. veronii DSM11331 | 4 | 847 | 4250 | 0.20 | 5 | 7 | 83 | 0.10 | 0.14 | 3 | Ps. putida DSM291 | 5 | 374 | 2821 | 0.13 | 3 | 3 | 83 | 0.05 | 0.12 | 1 | Ps. putida B401 | 6 | 329 | 2638 | 0.12 | 3 | 2 | 83 | 0.05 | 0.11 | 1,谱图模式比对进行细菌鉴定,微生物鉴定得分及含义,25,MALDI Biotyper 1 样品 5 分钟96 样品(整盘) 30 分钟生化反应
11、测试鉴定法8 小时 数天,Can I identify microorganisms fast ?,Acetobacter aceti subsp. acetiAcetobacter pasteurianus subsp.lovaniensisAcetobacter pasteurianus subsp.pasteurianusActinomadura aurantiacaActinomadura libanoticaActinomadura lividaAgrobaterium tumefaciensArthrobacter globiformisArthrobacter oxydansAr
12、throbacter pyridinolisArthrobacter sulfureusBacillus alcalophilusBacillus cohniiBacillus sphaericusBrevibacillus brevisBrevibacterium linensCellulomonas flavigenaCellulomonas turbataCorynebacterium glutamicumComamonas testosteroniiGluconobacter oxydans subsp. oxydansGluconobacter oxydans subsp.oxyda
13、nsGordonia amaraeGordonia rubropertinctaGordonia terraeHalomonas denitrificansHalomonas elongataHalomonas elongataHalomonas halmophilaHalomonas halmophilaHydrogenophaga flavaHydrogenophaga pseudoflava,Methylobacterium mesophilicumMethylobacterium organophilumMethylobacterium radiotoleransMethylobact
14、erium rhodesianumParacoccus versutusParacoccus versutusPseudomonas balearicaPseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescensPseudomonas oleovoransPseudomonas putidaPseudomonas stutzeriPseudonocardia hydrocarbonoxydansRhizobium leguminosarumRhodococcus coprophilusRhodococcus fasciansRhodococcus globeru
15、lusRhodococcus rhodniiRhodococcus rhodochrousRhodococcus ruberSinorhizobium melilotiStarkaya novellaStarkaya novellaStreptomyces albusStreptomyces avidiniiStreptomyces azureusStreptomyces badiusStreptomyces griseusStreptomyces hirsutusStreptomyces lavendulaeStreptomyces phaeochromogenesStreptomyces violaceoruberStreptomyces viridisporus,4600种微生物菌株，可直接应用于微生物鉴定 用户可使用软件自行生成新的微生物的标准谱图 模式 并用于鉴定,质谱仪建立的微生物数据库（主库）,请多指正谢谢！,