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1、吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维及粘着斑重构作用和细胞功能的实验研究第一部分眼外肌来源成纤维细胞的原代培养、鉴定及诱导分化目的 : 研究TAO眼外肌来源的成纤维细胞,在TGF-B 1作用下的细胞生长分化状态。 方法：通 过组织块培养法收集TAO眼外肌来源的成纤维细胞,进行细胞形态及免疫标记物 鉴定为成纤维细胞；通过MTT法观察成纤维细胞在不同浓度 TGF-B 1(1卩g/L、5 卩g/L、10卩g/L)诱导后的增殖效应；通过免疫细胞化学法检测成纤维细胞表达 a -SMA;通过 Western检测不同浓度(1卩g/L、5卩g/L、10卩g/L)和时间(24h、48h、 72h)效应下,TGF-
2、 B 1诱导成纤维细胞表达a -SMA水平。结果:原代和传代培养的细胞呈长梭形，胞浆丰满,核呈圆形或椭圆形，核仁清晰 , 细胞融合后呈放射状、漩涡状排列紧密 ； 免疫细胞化学染色显示:vimentin 阳性表达Qesmin、Kerati、S-100、第毗因子呈阴性反应,可以鉴定TAO组和正常对照组眼外肌标本培养的细胞为成纤维细胞。MTT法检测TGF- B 1诱导72h后的成纤维细胞增殖率具有剂量效应,10卩g/L TGF-B 1组细胞增殖 率最高,为107.35%(P< 0.05);TAO组和正常对照组的成纤维细胞 MTT光密度值比 较,差别不具有统计学意义(P > 0.05) o
3、10卩g/L TGF-B 1处理24h,成纤维细胞胞浆丰满,体型增大,细胞足突增多； 免疫细胞化学染色显示胞浆内大量 a -SMA表达，强阳性染色；阴性处理组细胞内 表达a -SMA量少。Western-blot检测TGF-B 1诱导成纤维细胞表达a -SMA蛋 白具有剂量和时间效应,10卩g/L TGF- B 1处理48h具有最大表达量(P < 0.05);TAO组和正常对照组的成纤维细胞 a -SMA蛋白表达量相互比较,差别不具 有统计学意义(P > 0.05)结论:利用组织块贴壁法培养的成纤维细胞的形态学和免疫学特征明显, 可 用于甲状腺相关眼病的体外研究对象。TGF-B 1
4、具有促进成纤维细胞增殖和向肌 纤维母细胞分化作用,其诱导的a -SMA表达水平增高在一定范围内具有浓度和 时间依赖性。第二部分吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖、 分化、迁移及收缩功能的实验研究 目的：研究吡非尼酮对TAO眼外肌成纤维细胞的增殖、分化、迁移和收缩胶原作 用的影响。方法：在不同浓度TGF-B 1、吡非尼酮、地塞米松作用下,通过MTT法 检测成纤维细胞增殖作用 , 台盼蓝染色法检测细胞存活状态。在10卩g/L TGF- B 1、1.0mg/ml吡非尼酮、1000n M地塞米松作用下,利用 划痕实验检测细胞迁移作用 , 免疫细胞化学法检测细胞表达 a -SMA、 fibronectin 的作
5、用，以及凝胶收缩实验检测细胞收缩胶原的作用。结果：MTT法检测吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖率具有剂量效应，0.5mg/ml、1.0mg/ml吡非尼酮的72h细 胞增殖率，分别为-24.82%、-41.84%,二者MTT值与空白对照组比较,P < 0.05;吡 非尼酮较地塞米松具有更强的抑制 TGF-B 1诱导的细胞增殖作用(P < 0.05) o台盼蓝染色法观察不同浓度吡非尼酮作用 72h后，成纤维细胞活性良好， 未见明显细胞毒性作用。细胞划痕实验显示 ,TGF- B 1具有促进细胞迁移和融 合效应 ; 吡非尼酮抑制细胞迁移作用明显 (P< 0.05) o免疫细胞化学染色显示
6、, 吡非尼酮作用 72h 后成纤维细胞内无明显 a -SMA 表达；地塞米松组成纤维细胞内正常表达 a -SMA空白对照组、TGF-B 1组、地 塞米松组 72h 后均可见 fibronectin 在成纤维细胞内外高表达 , 并聚合成互相连 接的纤维网状结构；吡非尼酮组、吡非尼酮联合 TGF-B 1组72h后fibronectin 表达被抑制凝胶收缩实验显示,连续观察6天后,TGF- B 1组的收缩指数为59.38%,与空白对照组比较，显示强大的促进成纤维细胞介导的胶原收缩作用(P < 0.05);卩比非尼酮组、吡非尼酮联合TGF-B 1组的收缩指数分别为6.70%和8.02%,具有明显
7、 抑制成纤维细胞介导的胶原收缩作用 (P< 0.05); 地塞米松组收缩指数 25.48%, 与空白对照组比较无统计学意义(P > 0.05) o结论：吡非尼酮可抑制体外培养眼眶 成纤维细胞的增殖和向肌纤维母细胞表型分化 ; 抑制成纤维细胞 / 肌纤维母细胞 的迁移和胶原收缩作用；并且对fibronectin的表达也有明显的下调作用。吡非尼酮较地塞米松具有更强的抑制TGF-B 1介导的成纤维细胞增殖、分化、迁移和胶原收缩作用。第三部分吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维重构及粘 着斑成熟作用的实验研究目的：研究吡非尼酮对TGF-B 1诱导下的TAO眼外肌成 纤维细胞的肌动蛋白应力纤维
8、构建和粘着斑成熟分化的作用 ,以及相关信号通路 的影响。方法：在10卩g/L TGF-B 1、1.0mg/ml吡非尼酮作用下，利用免疫荧光技术和 共聚焦激光扫描显微镜观察肌动蛋白应力纤维、粘着斑蛋白和I型胶原形态及细胞定位,Western-blot 检测 Akt、Phospho-Akt、FAK Phospho-FAK蛋白的表达， 以及通过Max GelTM检测成纤维细胞在细胞外基质中的粘附作用。结果：共聚焦显微镜下观察，吡非尼酮抑制TGF-B 1诱导的成纤维细胞向肌纤维母细胞分化， 降低a -SMA阳性应力纤维构建；抑制paxillin 、tensin蛋白表达,抑制粘着斑分 化成熟, 相应粘着
9、斑面积和数量较空白对照组减小 (P< 0.05) oWestern Blot结果显示，吡非尼酮单独作用或联合 TGF-B 1均可抑制Akt 与磷酸化Akt,FAK与磷酸化FAK表达(P < 0.05); <非尼酮对Akt磷酸化抑制作用 更明显(P < 0.05)。细胞粘附实验表明，吡非尼酮作用24h后极少细胞粘附生长，明显抑制成纤维细胞对细胞外基质的粘附作用(P < 0.05)结论：通过下调TGF-B 1介导的Akt/FAK信号通路活化，吡非尼酮明显抑制a -SMA应力纤维构建和粘着斑分化成熟，降低细胞与细胞外基质粘附，阻碍成纤维 细胞发挥促纤维化作用 , 因此可用于对抗甲状腺相关眼病纤维化发展和改善临床 症状。