柱层析使用方法.doc

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1、柱层析（原理与装置）利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。 柱层析是层析 技术中的一类，依据其作用原理又可分为 吸附柱层析（原理见第97100页和第 101102页）、分配柱层析（原理见第9192及9495页）和离子交换柱层析 等。 其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也 可作为其他类型柱层析的参考。1.图3-35层析柱实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，如图 3-35a所示，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免 污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。 另一种是 将玻璃管下端

2、拉细，套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶 解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀， 而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速， 如图3-35b所示。此外，薄膜塑料柱如图3-35c，因使用方便、节省淋洗剂、减 少蒸发量等优点，应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的， 两侧常有 很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上 并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长， 下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气， 薄膜柱即因内部压强

3、大于外部而自行展圆。 待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1 ：8到1 : 50之间。柱身细长，分离效果好，但 可分离的量小， 且分离所需时间长； 柱身短粗， 分离效果较差， 但一次可以分离 较多的样品，且所需时间短。 如果待分离物各组分较难分离， 宜选用细长的柱子， 如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物， 则可选用粗而短 的柱子。最常使用的层析柱，直径与长度之比在1 : 8到1 : 15之间。(2)柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的3050倍，对于难以分离的混合

4、物，吸附剂的用量可达 100倍或更高。对于吸附剂 应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素，最后用实验方法选择和确定。市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗到其浸出液的 pH 值为 4，适用于分离酸性物质；碱性氧化铝浸出液的 pH值为910,用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。 中性氧化铝的相 应 pH 值为 7.5 ，适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的 其他类型化合物的分离。 硅胶没有酸碱性之分， 可适用于各类有机物的分离。柱层析所用氧化铝的粒度一般为 100150目，硅胶为 60100目，如果颗氧化铝和硅胶的活性各分五个等级

5、(见表 2-5) 。哪个活性级别分离效果最 好，要用实验方法确定，而不是盲目选择高的活性级别，最常使用的是U川级。 如果吸附剂活性太低， 分离效果不好， 可通过“活化”来提高其活性。 所谓“活 化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分， 提高其吸附活性的过程。 通常 是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。 “活化”的温度和时间应根据分离 需要而定。氧化铝一般在200C恒温4h,硅胶在105110C恒温0.51h。“活 化”完毕，切断电源，待温度降至接近室温时， 从烘箱中取出放进干燥器中备用。 有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好， 可将吸附剂放在空气中让其吸收一此外，一些天然产物带有多种

6、官能团， 对微弱的酸碱性都很敏感， 则可用纤 维素、淀粉或糖类作吸附剂。 活性碳是一种吸附能力很高的吸附剂， 但因粒度太 小而不常用。(3)淋洗剂是将被分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，所以也称为洗脱剂或 简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重 要。如果淋洗剂的极性远大于被分离物的极性， 则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸 附，从而将原来被吸附的待分离物“顶替”下来， 随多余的淋洗剂冲下而起不到 分离作用；如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性， 则各组分被吸附剂强烈吸附 而留在固定相中， 不能随流动相向下移动， 也不能达到分离的目的。 如果淋洗剂 对于被分离物各组分溶解

7、度太大， 被分离物将会过多、 过快地溶解于其中并被迅 速洗脱而不能很好地分离； 如果溶解度太小， 则会造成谱带分散， 甚至完全不能 分开。常用溶剂的极性大小次序也因所用吸附剂的种类不同而不尽相同，第 99100 页给出了在硅胶和氧化铝柱中常用溶剂所表现出的极性次序，可作为选择溶剂的参考，首先在薄层层析板上试选 (见图 3-40) ，初步确定后再上柱分离。如 果所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解性能也较大的溶剂， 反之则改用极除了分离效果外还应当考虑： 在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长 期共存不发生任何化学反应， 也不被吸附剂或被分离物催化而发生自身的化学反 应；沸点较低以利回收；毒性

8、较小，操作安全；适当考虑价格是否合算，淋洗剂的用量往往较大，故最好使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合适 的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种可以无限混溶的溶剂组成， 先以不同的配比在薄层板上试验， 选出最佳配比， 再按该比例配制好， 像单一溶 剂一样使用。 如果必须在层析过程中改变淋洗剂的极性， 不能把一种溶剂迅速换 成另一种溶剂，而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐渐加到正在使用的溶 剂中去，逐步提高其比例，直至所需要的配比。一条经验规律称为“幂指数增 加”， 例如，原淋洗剂为环己烷， 如欲加入二氯甲烷以增加其极性， 则不应立即 换为二氯甲烷，而应使用这两种溶剂的混合液，其中二

9、氯甲烷的比例依次为5%，15%， 45%，最后再换为纯净的二氯甲烷。 每次加大比例后， 须待流出液量为吸附 剂装载体积的 3 倍时再进一步加大比例。 这只是一般方法， 其目的在于避免后面 的色带行进过快， 追上前面的色带， 造成交叉带。 但如果两色带间有很宽阔的空 白带，不会造成交叉， 则亦可直接换成后一种溶剂， 所以应根据具体情况灵活运(4)在实际工作中， 被分离的样品是不能选择的， 但认真考察各个组分的分子结 构，估计其吸附能力， 对于正确选择吸附剂和淋洗剂都是有益的。 若化合物的极 性较大， 或含有极性较大的基团， 则易被吸附而较难被洗脱， 宜选用吸附力较弱 的吸附剂和极性较大的淋洗剂。

10、 反之，对于极性较小的样品则选用极性较强的吸 附剂和弱极性或非极性淋洗剂。 若各组分极性差别较大， 则易于分离， 可选用较 为短粗的柱子， 使用较少的吸附剂； 若各组分极性相差甚微， 则难于分离， 宜选 (5) 储存淋洗剂的分液漏斗一只， 接收洗出液的锥形瓶若干只， 其容积大小根据 淋洗剂的体积确定。玻璃毛少量，白沙少量，各自洗净烘干。若层析柱很小，也2.(1)湿法装柱时，将柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞，加入选定的淋洗剂至柱 容积的 1/4 ，用一支干净的玻璃棒将少量玻璃毛 (或脱脂棉 )轻轻推入柱底狭窄 部位， 小心挤出其中的气泡， 但不要压得太紧密， 否则淋洗剂将流出太慢或根本 流不出来

11、。将准备好的白沙加入柱中，使在玻璃毛上均匀沉积成约 5mn厚的一层。 将需要量的吸附剂置烧杯中， 加淋洗剂浸润， 溶胀并调成糊状。 打开柱下活塞调 节流出速度为每秒钟 1 滴，将调好的吸附剂在搅拌下自柱顶缓缓注入柱中， 同时 用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身， 使吸附剂在淋洗剂中均匀沉降， 形成均匀 紧密的吸附剂柱。 吸附剂最好一次加完。 若分数次加， 则会沉积为数层， 各层交接处的吸附剂颗粒甚细，在分离时易被误认为是一个色层。全部吸附剂加完后， 在吸附剂沉积面上盖一层白沙 （ 如柱很小，也可不用白沙而盖上一张直径与柱内 径相当的滤纸片 ） ，关闭活塞。在全部装柱过程及装完柱后，都需始终保持吸

12、附 剂上面有一段液柱， 否则将会有空气进入吸附剂， 在其中形成气泡而影响分离效 果。如果发现柱中已经形成了气泡，应设法排除，若不能排除，则应倒出重装。 装好的吸附柱各层材料的分布见图 3-36干法装柱时， 先将柱竖直固定在铁支架上， 关闭活塞。 加入溶剂至柱容积的 3/4 ，打开活塞控制溶剂流速为 1 滴/ 秒，然后将所需量的吸附剂通过一支短颈玻 璃漏斗慢慢加入柱中， 同时， 轻轻敲柱身使柱填充紧密。 干法装柱的缺点是容易 使柱中混有气泡。 特别是使用硅胶为吸附剂时， 最好不用干法装柱， 因为硅胶在 溶剂中有一溶胀过程， 若采用干法装柱， 硅胶会在柱中溶胀， 往往留下缝隙和气装填薄膜塑料柱时，

13、可先按图 3-35c 所示的那样用抽气法将薄膜展开成圆柱 形，在底部装入一段玻璃毛，吸附剂通过一个粗颈漏斗自柱顶装入。装至 1/3 处，将柱身在坚硬的表面上礅结实，再装入 1/3 ，再礅结实，直至装到需要的高 度。装成的薄膜柱应紧密结实， 可以像玻璃柱那样用夹子夹住， 再在其底部扎一 些小孔即可使用。 （2）加样亦有干法、湿法两种。湿法加样是将待分离物溶于尽可能少的溶剂中， 如有不溶性杂质应当滤去。 打开柱下活塞小心放出柱中液体至液面下降到滤纸片 处，关闭活塞， 将配好的溶液沿着柱内壁缓缓加入， 切记勿冲动吸附剂， 否则将 造成吸附剂表面不平而影响分离效果。 溶液加完后， 小心开启柱下活塞，

14、放出液 体至溶液液面降至滤纸片时，关闭活塞，用少许溶剂冲洗柱内壁 （ 同样不可冲动 吸附剂 ） ，再放出液体至液面降到滤纸处，再次冲洗柱内壁，直至柱壁和柱顶溶 剂没有颜色。加样操作的关键是要避免样品溶液被冲稀。在技术熟练的情况下， 也可以不关下部活塞，在每秒钟 1干法加样是将待分离样品加少量低沸点溶剂溶解，再加入约 5 倍量吸附剂， 拌和均匀后在通风橱中蒸发至干。 揭去柱顶滤纸片， 将吸附了样品的吸附剂平摊 在柱内吸附剂的顶端，在上面加盖滤纸片或加盖一层白沙。干法加样易于掌握， 不会造成样品溶液的冲稀，但不适合对热敏感的化合物。(3)液柱申I I沙一惧 或滤紙片）E吸附剂图3-36 淋洗样品加

15、入后即可用大量淋洗剂淋洗。随着流动相向下移动，混合物逐渐分成 若干个不同的色带，继续淋洗，各色带间距离拉开，最终被一个个淋洗下来。当 第一色带开始流出时，更换接收瓶，接收完毕再更换接受瓶，接受两色带间的空 白带，并依此法分别接收各个色带。若后面的色带下行太慢，可依次使用几种极 性逐渐增大的淋洗剂来淋洗。为了减少添加淋洗剂的次数，可用分液漏斗在柱顶 “自动”添加，如图3-36所示。分液漏斗的活塞打开，顶塞密封，尾部插进柱 上部的淋洗剂液面以下，当液面下降后，漏斗尾部露出，即有空气泡自尾部进入 分液漏斗，这就加大了漏斗内液面上的压力，漏斗内的淋洗剂就自动流入柱内， 使柱内液面上升，当液面淹没漏斗尾

16、部时，就不再有空气进入漏斗，漏斗内的淋 洗剂就不再流出。在使用薄膜塑料柱进行层析时，一旦色带形成并拉开距离，可 将柱吸干，用刀沿“空白带”处切开，将各色带分别萃取，各自蒸去溶剂，即得分离无色物质时需要显色。如果使用带萤光的吸附剂，可在黑暗的环境中用 紫外光照射以显出各色带的位置，以便按色带分别接收。但柱上显色远不如在薄 层板上显色方便。所以常用的办法是等分接收，即事先准备十几个甚至几十个接 收瓶，依次编出号码，各接收相同体积的流出液，并各自在薄层板上点样展开， 然后在薄层板上显色（相关的显色操作见薄层层析部分）。具有相同Rf值的为同 一组分，可以合并处理。也可能出现交叉带，若交叉带很少，可以弃

17、之，若交叉 带较多，或样品很贵重，可以将交叉部分再次作柱层析分离， 直至完全分开。例 如，某一样品经等分接收和薄层层析并显色处理后如图3-37所示。由图可知，1,7, 8号 接收液都是空白，没有任何组分，可以合并。26号为第一组分，可以 合并处理，913号为第二组分，1416号为第三组分，1720号为第四组分 其中第14号实际是一个交叉带，以第三组分为主，也含有少量第二组分。如果 对第三组分的纯度要求不高，可以并入第三组分；如果对第三组分的纯度要求甚 高，可将第14 !O- -OC- Q-OO-O- 9" *-CiO O-Od _d£_0-1 2 3 4 5 6 7 8 9

18、 10 111213 14 1516 17 18 1920图-个四组分样品録柱层析分离后用薄层检测的情况12。接收液編号，O接收液点样处，展开后羊点位置并模糊的样点°3.(1)要控制淋洗剂流出的速度。一般控制流速为1滴/秒。若流速太快，样品在柱中的吸附和溶解过程来不及达到平衡，影响分离效果。若流速太慢，分离时间会拖得太长。有时，样品在柱中停留时间过长，可能促成某些成分发生变化。 或流动相在柱中下行速度小于样品的扩散速度，会造成色带加宽、交合甚至根本a. 色带过宽，界限不清。造成的原因可能是柱的直径与高度比选择不当，或 吸附剂、淋洗剂选择不当，或样品在柱中停留时间过长。但更常见的却是在

19、加样 时造成的。若在样品溶液加进柱中后，没有打开下部活塞放出淋洗剂使样品溶液 降至滤纸片处，即急于加溶剂冲洗柱壁，造成样品溶液大幅度稀释，或过早加大 量溶剂淋洗，必然会造成色带过宽。所以溶样时一定要使用尽可能少的溶剂， 加b. 色带倾斜。正常情况下柱中的色带应是水平的，如图 3-38a所示。而倾斜 的色带如图3-38b所示，在前一个色带尚未完全流出时，后面色带的前沿已开始 流出，所以不能接收到纯粹的单一组分。造成色带倾斜的原因是吸附剂的顶面装c. 气泡。造成气泡的原因可能是玻璃毛或脱脂棉中的空气未挤净，其后升入 吸附剂中形成气泡，也可能是吸附剂未充分浸润溶胀，在柱中与淋洗剂作用发热 而形成，但

20、更大量的是在装柱或淋洗过程中淋洗剂放出过快，液面下降到吸附剂沉积面之下，使空气进入吸附剂内部滞留而成。 当柱内有气泡时，大量淋洗剂顺 气泡外壁流下，在气泡下方形成沟流，使后一色带前沿的一部分突出伸入前一色 带(见图3-38c)，从而使两色带难于分离。所以在装柱及淋洗过程中应始终保持图3-38 层析柱中的色带（虚线表示更换接收瓶处）d. 柱顶面填装不平。这时色带前沿将沿低凹处向下延伸进入前面的色带（见图 3-38d）e. 断层和裂缝。当柱内某一区域内积有较多气泡时，这些气泡会合并起来在 柱内形成断层或裂缝。图3-38e表示了裂缝造成的沟流，而断层相当于一个不平 整的装载面，它造成沟流的情况与图 38d