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1、李清华 公共卫生学院,1,第二节发酵基本工艺与发酵设备,主要内容一、发酵工艺流程二、常见发酵设备1、发酵罐的设计原则2、微生物细胞反应器3、动物细胞培养反应4、植物细胞培养反应器,2,从自然界分离的菌种,4,一、发酵工艺流程,典型的发酵生产过程包括：菌种的选育确定菌种繁殖和发酵生产所用的培养基；对培养基、发酵罐及其附属设备进行灭菌； 菌种经逐级扩大培养后，作为生产种子接种于发酵罐中 ;控制发酵罐中微生物的生长条件，最大程度地获得人们渴望的代谢产物 ;产物萃取和精制 ;发酵过程中废弃物的处理与回收.,菌种的选育,要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量等方面符合人们要求的产品，最重要的是要有优良的
2、菌种。,对菌种一般有以下要求：菌种能在较短的发酵过程中高产有价值的发酵产品。菌种的发酵培养基应价廉，来源充足，被转化为产品的效率高。如农副产品。菌种对人、动物、植物和环境不应该造成危害，还应注意潜在的、慢性的、长期的危害，要严格防护。菌种发酵后，所产不需要的代谢产物少，且产品相对容易地与不需要的物质分离，下游技术能用于规模化生产。菌种的遗传特性稳定，而且易于进行基因操作。,培养基的配制,进行发酵生产，有了优良的菌种还需要有与菌种相适应的培养基。在配制培养基时应该注意： （1）根据不同的菌种，应选择不同的材料配制培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，
3、并为微生物提供适宜的pH、渗透压等。（2）培养基的营养要协调，以利于产物的合成。（3）培养基在满足微生物的营养需求的基础上应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。,灭菌,发酵工程所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程中不能混入杂菌。在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响。例如：在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡；在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。,灭菌,那如何防止杂菌的污染呢？要在发酵前对培养基和发酵设施进行严格的灭菌处理。空消、实消怎样才算灭菌彻底呢？ 用高温、高
4、压的方式，杀死所有杂菌的胞体、芽孢和孢子。,扩大培养和接种,如何得到发酵生产所需要的大量菌体来缩短生产周期？经过多次的扩大培养。如何对菌种进行扩大培养？扩大培养是将培养到对数期的菌体分开，分头进行培养，以促使菌体数量快速增加，能在短时间里得到大量的菌体。,扩大培养和接种,扩大培养与发酵生产过程中的培养不同：扩大培养是为了让菌体在短时期内快速增殖，而发酵过程中的培养是为了获得代谢产物，目的不同采用的培养条件就有可能不同。例如：在酒精发酵过程中，扩大培养是为了促使酵母菌快速增殖，因此是在有氧条件下进行。而在发酵产生酒精的过程中则必须在无氧条件下进行以获得大量的酒精。有了用于生产的充足的菌体，接种过
5、程中要注意防止杂菌污染。,发酵过程,为什么将菌体接种到装有培养液的发酵罐中，还需要对发酵过程进行检测和对发酵条件进行控制？发酵产物主要在菌体生长的稳定期产生。因此，要在发酵过程中随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多的发酵产物。同时，还应对发酵条件进行严格控制。,发酵过程,哪些条件能影响菌体的发酵？发酵生产中发酵罐内部的代谢变化，如菌体形态、菌体浓度、营养物质的浓度、温度、pH、溶氧量、产物浓度、以及发酵罐搅拌转速等对发酵过程都有重大影响。,分离、提纯,代谢产物采用离心、过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来。菌体
6、本身，如酵母菌和细菌等采用蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。,二 、发酵设备,生物反应器(发酵罐),利用生物工程技术进行生产的过程统称生物反应过程 。,采用活细胞(包括微生物、动植物细胞)的某些特定功能生产有用产品的生物反应过程称为发酵过程或细胞培养过程。采用游离或固定化酶作为生物催化剂的生物反应过程，称为酶反应过程。,生物反应器：利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统。,生物反应器应具备的条件：能维持一定的温度、pH、反应物(如营养物质、溶解氧等)浓度；应具备良好的传质、传热和混合性能，以便为生物反应的顺利进行提供适宜的环境条件；细胞生物反应器除具备上述特
7、性外，还要求有一定的除菌及密封设备，以防止生产过程中因微生物侵入造成的杂菌污染。,根据生物反应过程中所使用的生物催化剂不同可将生物反应器分为：酶反应器和（微）细胞生物反应器。,（一） 发酵罐设计的原则,发酵罐的主要功能：为菌体生长，或为某一特定的微生物混合发酵剂提供一个便于控制的环境，以获得人们所期望的产物 。,发酵罐设计的原则,1、发酵器应能在无菌条件下工作数天，且应在长时间运转过程中保持稳定；2、通气和充分搅拌，以满足微生物代谢的需要，但不应损伤菌体；,3、尽可能低的功率消耗；4、发酵罐上应配备有温度和pH值控制系统以及采样装置 ；5、发酵罐内的蒸发损失不应太多； 6、在放料、清洗和维修等
8、操作过程中具有最低的劳动力消耗；,7、发酵罐应有较好的适应性，以满足不同生产厂家的需求； 8、发酵罐内表面应光滑；9、用于中试规模的发酵罐与用于实际生产的发酵罐应具有相同的几何形状，有利于放大生产；10、使用既能满足工艺要求又比较便宜的制造材料，同时应配备完善的供给设施。,发酵罐（总结）稳定性 控制性 操作性 安全性 可视性,设计原则,（二）微生物细胞反应器,依搅拌方式不同，微生物细胞反应器有： 内部机械搅拌型外部液体搅拌型气升循环式发酵罐,微生物反应器,1、机械搅拌型微生物细胞生物反应器(通用型),主要由壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统等组成。,BIOTECH
9、- X JS型机械搅拌不锈钢发酵罐,壳体的作用：一般为不锈钢材料，为整个发酵过程提供一个密封的环境，防止杂菌污染；同时为了能在一定压力下进行高温灭菌，要求罐体承受的压力至少在0.3MPa以上。控温部分的作用：是保证发酵过程在恒温条件下进行，并将生物氧化和机械搅拌产生的热量及时移去。搅拌部分的作用：使罐内物料混合良好，液体中的固形物料保持悬浮状态，有利于菌体与营养物质充分接触，便于营养吸收。另一方面，打碎气泡，增加气液接触面积，提高气液间的传质速率，加强氧的传递效果及消除泡沫。,通气部分的作用：是从罐的底部向罐内通入无菌空气，一般入口空气压力为0.10.2MPa(表压)，罐顶部有空气出口。 进出
10、料口：是指进料和出料用的系统，同时还配有补料口装置等 测量系统：在于测量发酵过程中的pH值、溶解氧等相关数据，以便对发酵过程进行随时的监测并及时对发酵参数进行调整。此外，测量装置应能承受一定的灭菌温度并在长时间内保持稳定。,通用机械搅拌型生物反应器内通常安装消泡装置，抑制泡沫的形成，但泡沫过多时，要使用消泡剂。 附属系统是指用以观察发酵液情况的视镜装置和强化发酵液混合（防止液面中央产生旋涡，提高溶解氧）的挡板等设备。,2、机械搅拌自吸式反应器,优点：（1）可以利用搅拌器旋转时产生的抽吸力吸入空气，不需要空气压缩机提供压缩空气，从而省去了空气系统，使设备成本降低。（2）其搅拌器是一个空心叶轮，叶
11、轮快速旋转时，液体由于离心作用而被甩出，并在叶轮空心部分形成负压，从而将罐外的空气吸到罐内。同时，空气因受到高速流动液体的摩擦剪切作用而变成细小的气泡，均匀分散在液体之中，然后借助导轮流将气液混合物导入发酵液中并与之混合。,缺点 （1）进罐空气处于负压状态，容易增加杂菌侵入的机会。（2）搅拌容易导致转速提高，有可能使某些微生物的菌丝被切断，影响细胞的正常生长。,3、气升式环流反应器,类型：内环流式、外环流式,气升式发酵罐不具有任何机械搅拌系统，仅利用空气在发酵罐内（外）循环以搅拌培养物，这一相对柔和的混合系统适用于植物细胞和动物细胞培养。原理基于含气量高的培养物和含气量少的培养物之间比重的差异
12、。在发酵罐通气过程中，含气量较低的培养基产生一上流的推力，导致培养基的循环。借助设在环流管底部的空气喷嘴将空气以250300m/s的高速喷入环流管，使气泡分散在培养基中。,气升式玻璃系列实验室发酵罐,气升式环流反应器的优点,（1）气体从罐的下部通入，可带动流体在整个反应器内循环流动，使反应器内的溶液容易混合均匀；（2）由于不用机械搅拌桨，省去了密封装置，使污染杂菌的机会减少，同时降低了机械剪切作用对细胞的伤害；（3）由于液体循环速度较快，反应器内的供氧及传热都较好，利于节约能源。,气升式环流反应器不适宜于在黏度大或含有大量固体的培养液中应用。,衡量气升式环流反应器性能的参数主要有：,循环周期气
13、液比。循环周期：指培养液在环流管内循环一次所需的时间。气液比：指培养液的环流量与通风量之比。循环周期越短，气液比值越大，说明向培养基内供氧越充分。,4、高位塔式生物反应器,是一种罐体的高与直径比值较大，利用通入培养液的无菌空气泡上升来带动液体运动，产生混合效果的非机械搅拌式生物反应器，适用于培养液黏度低、固体含量少和需氧量较低的发酵培养过程。,与机械搅拌式生物反应器相比，塔式生物反应器不设机械搅拌桨的优点是：,（1）减少了剪切作用对细胞的损害；（2）结构简单，省去了密封，排除了因密封不严而造成的杂菌污染；（3）造价较低，动力消耗少，操作成本低，噪声较小。 缺点：这种反应器罐体较高，需要在室外安
14、装，而且压缩空气必须有足够大的压力才能抵消反应器内液体的静压力。,（三）动物细胞培养生物反应器,气升式生物反应器中空纤维反应器笼式通气搅拌反应器流化床反应器,1、气升式细胞培养生物反应器,将气体混合物从罐底部的喷射管喷入反应器的中央导流管，使中央导流管内的液体密度低于外部区域液体的密度，从而形成循环。在气升式生物反应器中，可以通过自动调节空气进入的速率来实现对溶解氧浓度的控制；pH值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠的方法来控制。,BIOTECH-X QS型气升式发酵罐,2、中空纤维管生物反应器,既可培养悬浮型的细胞，又可培养贴壁型细胞，培养的细胞密度甚至可达到109个/mL数量级，主要
15、用于杂交瘤细胞的培养来生产单克隆抗体。,中空纤维管生物反应器培养的细胞和获得的分泌产物,3、通气搅拌生物反应器,（1）Spier笼式通气搅拌生物反应器优点：可以避免通气时气泡直接损伤细胞。它是借助一个多孔的通气装置在笼内通气，满足培养过程中细胞对溶解氧的需要。缺点：是不能进行在线灭菌，只能将罐体放在消毒锅内进行高压灭菌；氧传递系数小，不能满足培养高密度细胞的耗氧要求；反应器的结构相对复杂，拆卸清洗困难。,（2）CelliGen-20双层笼式通气搅拌生物反应器,优点：扩大了丝网交换面积，使氧传递系数提高，单位面积产量增加，形成了由双层笼式通气搅拌器、控制系统、管路系统和蒸汽灭菌系统一体化的动物细
16、胞培养装置。适于悬浮培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体、微载体培养Vero细胞和乙脑病毒。,4、流化床生物反应器,特点：在反应器内，通过垂直向上循环流动，培养液不断供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长。同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。 流化床生物反应器可用于贴壁依赖型细胞的培养和非贴壁依赖型细胞的培养。,5、无泡沫搅拌生物反应器,特点：能满足动物细胞生长中所需的溶氧要求，产生的剪切力较小，在通气过程中不产生泡沫。,（四） 植物细胞培养反应器,类型：机械搅拌式生物反应器气升式生物反应器填充床生物反应器流化床生物反应器膜式生物反应器,1、机械搅拌生物反应器,特点
17、：机械搅拌会产生较大的剪切力，损伤细胞，同时容易引发杂菌污染，所以植物细胞培养中一般不用机械搅拌反应器。,2、气升式生物反应器,特点：减少了剪切力的作用，避免了细胞损伤，而且在操作中容易保持无菌状态，比较适宜于植物细胞培养。,3、填充床生物反应器,特点：在填充床生物反应器中，细胞可以位于支撑物表面，也可以包埋于支撑物之中。培养液流经支撑物颗粒，不断被细胞所利用。,优点：单位体积固定细胞量大。缺点：混合效果较差，给氧的传递、pH值控制、温度控制以及气体产物的排除带来了困难，从而影响细胞的培养,4、流化床生物反应器,流化床生物反应器的最大缺点是剪切力和颗粒的碰撞会损坏固定化细胞。,通常采用小固定化
18、颗粒。,5、膜生物反应器,膜反应器的优点是可以重复使用,57,一种植物细胞表面固定化培养系统，避免了传统搅拌罐悬浮培养中的流体流动力或剪切力问题，并促进植物细胞凝聚的特性，使次级代谢产物合成和积累增加，而且该系统培养基交换简单，次级产物提取容易。植物细胞膜反应器，将细胞固定在膜上3mm厚一层，培养基在膜下封闭回路循环流动，营养透过膜扩散至细胞层，次级代谢物分泌透过膜扩散至培养基。Humphrey对植物细胞培养微孔膜通气反应器进行了研究，分析了氧传递，为需要小剪切力的植物细胞培养的膜通气反应器提供设计依据，设计应考虑的因素包括管的长度、直径和膜厚度，进气的组成和压力，细胞生长培养阶段等。,58,谢谢！,固体发酵罐,中试磁力搅拌不锈钢发酵罐,机械搅拌不锈钢发酵罐,