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1、CRISPR-Cas系统基因修饰技术1 CRISPR-Cas概述u1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。u2013以后，研究者们在包括science和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。1 CRISPR-Cas概述CRISPR-Cas
2、：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR-Cas主要由两部分组成：识别切割1 CRISPR-Cas概述1.1 CRISPR结构CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（sp
3、ace）与靶基因进行识别。1.1 CRISPR结构1.2 Cas家族Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。2 CRISPR-Cas系统的发现 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。2 CRISPR-Cas系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针
4、对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。2 CRISPR-Cas系统靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。2 CRISPR-Cas系统靶向要求 在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。2 CRISPR-Cas系统靶向要求3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰3.1 dual-RNA：Cas
5、介导编辑模板替换 2013年1月29日在nature biotechnology上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰 2013年1月29日在nature biotechnology上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system
6、一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰Cas9sg-RNA 2013年2月15日在science上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰 3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰 4 CRISPR-Cas系统前景
7、分析 这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。4 CRISPR-Cas系统前景分析 2013年4月12日在cell stem cell上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。4 CRISPR-Cas系统前景分析 而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。4 CRISPR-Cas系统前景分析u 只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。u 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。u 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。技术优势