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1、茚三酮比色测定氨基酸含量一、实验原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物 （除脯氨酸外均有此反应） ，可用吸光光度法测定。 生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm 或 350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。二、实验试剂（1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮 1g 于盛有 35mL 热水的烧杯中使其溶解，加入 40mg 氯化亚锡（ SnCl2? H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至 50mL，摇匀备用。（2）pH 8.04 磷酸缓冲液：、准确称取磷酸二氢钾（ KH 2PO4）4.5350g 于烧杯中，用少量蒸
2、馏水溶解后，定量转入 500mL 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。、准确称取磷酸氢二钠（ Na2HPO4 ）11.9380g 于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入 500mL 容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。、取上述配好的磷酸二氢钾溶液 10.0mL 与 190mL 磷酸氢二钠溶液混合均匀即为 pH8.04 的磷酸缓冲溶液。（3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸） 0.2000g 于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入 100mL 容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL 于 100mL 容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200g/mL氨基酸标准溶液。三、
3、实验方法及步骤（1）标准曲线绘制准确吸取 200g/mL的氨基酸标准溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于 0、100、200、 300、 400、500、600g 氨基酸），分别置于 25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL ，然后加入茚三酮溶液（ 20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（ pH 为 8.04）各 1mL，混合均匀，于 90水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要 25 分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置 15min 后，若生成蓝紫色化合物，在 570nm 波长下，以试剂空白为1参比液测定其余各溶液的吸光度 A ；若
4、生成的化合物呈黄色，则在 350nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度 A 。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，绘制标准曲线。0.70y = 0.000935x + 0.0026790.600.50/ 0.40值A度光 0.300.200.100.000100200300400500600700氨基酸含量 /g图 1350nm 波长下氨基酸与吸光度线性关系图（雷恩，2016）（2）提取样品称取 1.0-2.0g 植物样品（新鲜样或干样） ，加 5mL 10% 醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入 100mL 容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。该样品提取液可继续
5、用来测定可溶性蛋白质含量（考马斯亮蓝 G-250 法）（3）样品测定吸取澄清的样品溶液4mL ，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度 A 值，测得的 A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。（4）结果计算氨基酸含量（ g /100g） =式中：c从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，g；m 测定的样品溶液相当于样品的质量，g。四、说明及注意事项（1）茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法如下：取10g 茚三酮溶于 40mL 热水中，加入 1g 活性2炭，摇动 1 分钟，静置 30 分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用 2
6、mL 冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用。（2）应控制反应溶液的pH 才能得到重现性好的结果， 反应液 pH 在 6.2 - 6.4之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2:1 或 1:1。（3）要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。沸水浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度（ 80），延长加热时间，使发色均匀。也可以在烘箱中加热， 105烘 10 分钟。（4）茚三酮与氨基酸反应生成的颜色在 1 小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。（5）明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸（酪氨酸等）也被活性炭吸附，会使结果降低。（6）茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。（7）植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理3