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1、第五节 荧光原位杂交（FISH）,染色体显带技术的优缺点,染色体显带是细胞遗传学分析技术中不可替代的基本方法。“金标准”操作简便，经济可以提供核型的完整图像影响因素：染色体相似性很强，复杂畸变时；或畸变微小（如缺失5Mb)，不足以引起图像明显变化时，结果分析困难。耗时（培养需72小时）且依赖于获得良好的分裂相，而有的标本中分裂指数低，或染色体形态学表型差。,一、FISH原理,（一）、几个概念杂交原位杂交荧光原位杂交,依据DNA双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列，这一过程叫做杂交。,原位杂交(in situ hybridiz
2、ation)是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。,原位杂交,1）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization)70年代2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization)80年代中后期（1）免疫酶联（2）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)*同位素原位杂交的不足：1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐;5）同位素的使用和处理,荧光原位杂交（FISH）,FISH
3、技术是常规染色体分析的辅助手段。它是用荧光素标记特异探针，与染色体做杂交后，根据特异的荧光信号来判断结果。它可用于标记染色体的识别、特异融合基因的检测，并可广泛用于肿瘤的诊断分型，新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复杂的染色体结构异常等。,原理：通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。,二、FISH的优点：,1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到结果。3.在同一标本上，可同时几种不同探针，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型。 4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研究，而且
4、还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。,三、FISH探针,用生物素或地高辛标记称为间接标记。 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号。,优点：在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大缺点 步骤较多, 操作麻烦。,（一）、直接标记和间接标记,直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记。优点：由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应。由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针应用越来越多。,探针标记,在已知探针DNA结构及序列情况下可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用Biotin标记的探针应大于100bp，较小的探针可
5、采用PCR技术来标记。近年来，VYSIS公司成功的生 产了大片段的DNA探针（100400kb）。由于探针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化面且杂交信号增强。,（二）、FISH探针的种类,1）单拷贝探针：（1）种类：酵母人工染色体（YAC），细菌人工染色体（BAC），Cosmid，Plasmid，cDNA片段（2）应用（a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证；（b）确定染色体微小缺失与重复；（c）染色体断裂点分析。,）简单重复序列探针(simple repetitive probes） 其靶序列为卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/sat
6、ellite III DNA)多位于染色体的着丝粒，异染色质区域和端粒，重复数百次至数千次。特点：信号强应用：(a)标记染色体识别(b)染色体数目异常检测(c)同时由于G显带时，端粒区是苍白的，因此涉及此区的易位常难以检测，而应用端粒探针则弥补了G显带的不足,3）染色体涂染探针（chromosome painting probes)整条染色体探针或染色体区带特异性探针包括通过流式细胞仪（FACS）分选或显微切割获得的全染色体，染色体臂，或染色体特异性区带涂抹探针应用：检测染色体数目或结构异常。,四、FISH的临床应用,1.在细胞遗传学检查中，重复序列的探针应用最多，它们是卫星DNA、卫星DNA
7、和经典卫星DNA探针。卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝粒。卫星DNA位于顶端着丝粒染色体及染色体的异染色质 周围。经典卫星DNA有着AATGG短片段，位于染色体1、9、15、16和Y染色体长臂异染色质周围，后两处探针除了可用于染色体数目检查外，还可用于上述部位精细改变的检查。,染色体着丝粒荧光,染色体端粒荧光,FISH检测18三体及Turner综合征结果左图： 18（蓝色）X(绿色)Y（红色）探针，显示18号、X和Y染色体为正常；中图：18三体综合征病例的FISH结果，有三个蓝色信号（18号）；右图：Turner综合征病例的FISH结果，1个绿色信号（X单体）,FISH检测21三体综合征结
8、果 左图：以13（绿色）21（红色）为探针，显示13号和21号染色体为正常；中图及右图：21三体综合征病例的FISH结果，有三个红色信号（21号）。,对于临床来说，对母血清唐氏筛查异常的高危孕妇，可以考虑选择FISH检测。 因为血清学筛查主要针对21、18、13一三体发病风险的统计，80的常见染色体异常发生在2l、18、l3、X及Y这5对染色体，而FISH针对这些血清学异常已达到很高的特异性及敏感性，且FISH的快速简便，可以极大的缓解孕妇的焦虑情绪。晚孕期的的孕妇也建议使用FISH检测。 因为晚孕期羊水培养失败率较高，而脐血穿刺流产的风险较高，选择FISH检测快速用于临床诊治指导，减轻孕妇的
9、焦虑及负担。,FISH检测与传统核型分析相比具有对孕周无严格要求，快速，简便，需要样本量小，可以检测微小缺失等优点，但它也有仅能检出部分染色体数目异常，不能检出染色体结构异常的缺点。,2.血液病检测大部分白血病存在某种染色体易位，产生新的融合基因，编码新的融合蛋白。利用这些标志可以诊断不同类型的白血病。特殊染色体异常往往同时有特征性的形态学异常和独特的临床特点，染色体核型与AML患者的预后和治疗密切相关，因此细胞遗传学在WHO分型中占据了重要地位。例如：WHO 2001年建议，急性白血病（AML）被划分为以下四组： (1)急性髓系白血病伴重现性染色体异常； (2)急性髓系白血病伴有多系细胞增生
10、异常； (3)治疗相关的急性髓系白血病与骨髓增生异常综合征； (4)不能归类的急性髓系白血病。,检查 初始治疗 HLA配型 体格检查 Southern BCR-ABL阴性 血小板、血细胞记数 Ph1阴性 Western BMTa 生化全套 PCR 成人CML 骨穿活检 FISH BCR-ABL阳性慢性期 形态学观察 幼稚细胞百分比 进行起始治疗（CML-2） 嗜碱性细胞百分比 核型分析 Ph1阳性 a,NCCN:国家综合肿瘤网肿瘤学临床实践指导2004年第一版 慢性髓性白血病2004年第一版,细胞遗传学和血液学缓解的标准1血液学完全缓解 末梢血完全正常，白细胞 450109/L 持续脾大但范围
11、小于治疗前的50%。1摘自Faderi D 等所著：慢性粒细胞白血病：生物学及治疗。发表于Ann Intern Med 131:207-219,1999。2至少检查20个分裂象。,肿瘤基因变异（或统称突变）的发生是一个累积的和概率的过程 。我们每个人体内都在发生着突变，实际上大多数突变是无意义的，因此，一个肿瘤患者基因组内可能有很多变异，可以表现为不同的形式。有的是决定意义的，比如BCR-ABL1融合基因；有的也有一定的辅助意义，如复杂的染色体异常或特定的基因变异。不仅肿瘤的发生是一个动态过程，肿瘤发生后它的基因组也在持续的发生着动态的变化。一旦出现了新的有意义的突变，还会导致疾病的进展。如部
12、分CML患者发病时只能看到和检测到BCR-ABL1融合基因，但发生急变时就能看到复杂的染色体异常或IKZF1基因的变化。实际上是由于后来发生了更多的基因的异常，才导致了CML进展为急性白血病。,FISH检测不需要进行细胞培养，是临床遗传学检测的有效补充手段： 传统的染色体检查方法周期长，人工消耗大，而且染色体分析需要有较好质量的中期分裂相。白血病患者肿瘤细胞中期分裂相不易获得，而且有些重要预后意义的累及基因位点的微缺失或仅存在于间期细胞中的异常，传统的细胞遗传学技术是不能检测出来的。 荧光原位杂交技术不需要中期分裂相，因此可分析大量间期细胞，且具有操作相对简单、重复性好、敏感性和特异性高的优点
13、。但需要指定基因特异性的探针，失去了核型分析的宏观性。,Translocation t(9;22)(q34;q11),Translocation t(9;22)(q34;q11),在正常的细胞中，两个红点和两个绿点分别表示正常的ABL和BCR基因的正常位置。在不正常的细胞中，BCR-ABL融合基因呈现为红绿两种颜色的融合，这种融合基因常常在观察中显示为黄色荧光（箭头所指）。,五、几种新技术介绍,1.多色荧光原位杂交（M-FISH）采用全染色体探针（WCP）与染色体杂交，分析染色体数量和结构异常的分子生物学方法。探针是经过聚合酶链反应(Degenerate oligonucleotideprim
14、edpolymerase chain reaction, DOP-PCR)扩增、流式分选、 并用 5 种荧光素组合荧光标记法标记的同源染色体。这种经过标记的探针集合(Pool)与制备好的间期细胞染色体杂交, 可使杂交后的每条染色体表现出独有的颜色, 从而能够分辨出人的22 对常染色体和X、Y 两条性染色体(图215), 杂交后的图像通过滤光装置被计算机获得并分析得出结果。如果一条染色体的颜色不相同, 则提示该条染色体有重组现象, 根据每条染色体各自独有的颜色, 可以知道哪几条染色体之间进行了重组,M-FISH 对染色体间复杂易位的分析有突出优势, 但是对染色体微小易位(1MB)的分析则受到限制
15、, 而对染色体内部异常的分析则无能为力, 这包括染色体的扩增、微小缺失和倒位,染色体光谱核型比对分析技术（SKY-spectral-karyotyping)-创新的染色体数目和结构异常检查工具原理：光谱核型分析SKY经由CCD相机撷取图像，利用光谱干涉仪及傅立叶转换技术，分辨获得图像每一像素点的光谱，以此标定出不同光谱的不同颜色。优势： 对比传统的M-FISH,光谱核型分析技术的采用优势无法比拟。一 传统的技术使用显微镜荧光滤镜来分辨荧光信号，缺点存在严重的荧光信号干扰（cross-talk),信号重叠，信号位移等，无法有效分辨染色体，也无法准确诊断染色体的细微变异，异位。而SKY完全克服以上
16、缺点，对图像每一像素的光谱标以不同颜色，显而易见。二 从成本上看，不需要电动显微镜，荧光滤镜仅使用一颗SKY滤镜，SKYPaint探针做一次杂交，一次图像撷取，让使用人员减轻时间，精力，同时获取稳定结果。,4. 比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization (CGH),原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具,比较基因组杂交（CGH）,CGH不需要制备患者的染色体标本, 只需采用肿瘤患者的基因组DN
17、A和正常人的基因组DNA作为探针，与正常人的中期染色体分裂相进行杂交。比较两种探针所标的荧光信号的强度比率来判断肿瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或复制。 因而CGH最适合于检测实体瘤, 淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病. CGH另一无法替代的优点是, 它可在一次杂交中检测整个基因遗传 物质的增加或减少, 但精度有限, 对微小的扩增或缺失检测不出, 仅适用于对整个基因组进行筛查. CGH也无法发 现平衡染色体易位.,比较基因组杂交原理示意,肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少 因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或
18、丟失,等比混合,比较基因组杂交过程,DAPI4,6-二联脒-2-吲哚苯,FITC异硫氰酸酯,TRITC硫氰酸四甲基罗丹明,人染色体不同荧光素染色结果,数字化图像,FITC/TRITC 荧光强度比率分析图Ratio image FITC/TRITC,比较基因组杂交应用范畴,可在基因组水平上对染色体变异部位进行准确的定量定位分析；不需要细胞培养可对肿瘤基因组DNA的拷贝数进行定性分析与定量分析；对细胞遗传学难以判断的肿瘤染色体的某些成分（如双微体、标记染色体）的来源进行鉴定；快速检出染色体三体性、单体性和部分染色体大片段重复的拷贝数变化，有利于对先天畸形、自然流产等疾病进行快速诊断。,优势： 可快
19、捷检测中期、间期基因组 不需预先知道DNA发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减,多色信号采集,常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像， 彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标记探针的应用，使用CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统融合各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。,FISH和G显带技术结合,对已做过G显带的染色体片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）,不仅可以用新近G带外理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FIS
20、H技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析。,FISH技术和其他技术的结合,FISH技术和RFLP结合，可以精确地描述原属于染色本长短臂等结构改变和染色体核形或复杂片段的性质。FISH和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种颜色反应不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点。转录和翻译和产物，有助了解核苷酸结构功能以及表达产物之间关系的研究。,FISH的应用(1)基因定位与基因制图（gene mapping） 原理前面已叙述。FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。(2)基因诊断(gene diagnosis) 精确、直观、明了(3)间期细胞遗传学（inter
21、phase cytogenetics）(4)FISH在肿瘤生物学中的应用 肿瘤细胞遗传学（onco-cytogenetics）；基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位；病毒基因插入基因组部分的检测：虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主，也有像腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治肿瘤均具有重要意义；基因的扩增与缺失：原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有：
22、突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：点突变、基因缺失。FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。,多色荧光原位杂交（M-FISH）,M-FISH相当于在 一次杂交中给每一条染色体都涂上了不同的颜色, 因而很容易就可看到多条染色体间的复杂易位情况和确定标志染 色体的来源. M-FISH是1996年才建立的一种新技术。使用5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成24条染色体上24种特异的荧光色彩以供核型分析。它为人们提供了既丰富又完善的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位 。,多色荧光染色体显带（Rx-FISH）,能否让每条区带也杂交上不同的颜色呢? 这一想法导 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的诞生. Rx-FISH技术是采用多种荧光素标记与人类DNA有高度同原性猿的DNA作为探针，杂交后使人类的24条染色体上呈现特异的带型。这样便可根据彩色的荧光条带进行核型分析。,