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1、枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析,2008.12.05,实验目的,从枯草芽孢杆菌中分离提取碱性磷酸酶进行酶活分析,实验原理,碱性磷酸单酯酶（EC:3.1.3.1）又称碱性磷酸酯酶，碱性磷酸酶，官方英文名为Alkaline phosphatase,碱性磷酸单酯酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中。其用途一般有：1）在用32P标记5末端前，去除DNA或RNA的5磷酸。2）去除DNA片段5磷酸以防止质粒DNA连接和自身环化。,盐析 根据不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同而利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出的方法称为蛋白质的盐析。,实验材料,枯草杆菌发酵液Tri
2、sHCl缓冲液（pH7.4、9.5）1mol/L MgCl2 溶液40mmol/L 对硝基酚磷酸（NPP）溶液,实验步骤,细胞培养与收集每组取约50mL枯草杆菌发酵液8000rpm离心5min，收集菌体弃去上清。用pH7.4的TrisHCl缓冲液洗涤菌体一次并弃去上清。碱性磷酸酶的提取得到菌体沉淀后，每管加入5mL pH7.4的TrisHCl缓冲液，使细胞重悬。然后再加入1mL 1mol/L MgCl2 溶液，于室温振荡10min；8000rpm离心5min，取上清液即为粗酶液。取样测酶活。,硫酸氨盐析将上述粗酶液，缓慢加入硫酸铵粉末，使之达到50饱和度（313g/L），12000rpm离心5min，去除杂蛋白沉淀。取上清液，再加固体硫酸铵，使之浓度分别达到70、75、80、85、90 充分溶解后，12000rpm离心5min。得到粗酶沉淀。透析处理沉淀用2mL pH7.4的TrisHCl缓冲液溶解，装进透析袋，在室温下透析1周。取样测定纯品酶活。,酶活测定,酶活力单位：在420nm波长吸光度每变化0.001定义为酶的一个活力单位。,实验结束卫生大扫除,11,