《生化实验整理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化实验整理.docx（10页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、生化实验整理1.氨基酸的分离鉴定纸层析法一、实验目的/ 了解层析技术的一般原理/掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分二、实验原理层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差 异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流 过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作 用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交 换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质 能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用流动
2、相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液 体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度） 的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距 离与流动相本身移动的距离之比值，常用品来表示分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离 的先决条件，差异越大，分离效果越理想层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为 纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层 析
3、和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤 层析、离子交换层析等纸层次是以漉纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水 性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物 时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在 滤纸上的移动速度用R值表示：Rf =在一定条件下，某种物质的R值是常数。凡值的大小与物质的 结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 氨基酸显色反应一一弹三酮反应原理：厂 所有的a -氨基酸及一切蛋白质都能和苗三酮反应生成蓝紫色物质， 除了脯氨酸、羟脯氨酸和黄三酮反应产生黄色物质广 该反应分为两
4、步：第一步是氨基酸被氧化形成CO?、阳和醛，水合 萍三酮被还原成还原型苗三酮；第二步是所形成的还原型苗三酮结合另一分 子水合苛三酮和氨缩合生成有色物质三、实验器材大试管及塞子，大头针，三角薄层喷瓶，毛细管，吹风机，层析滤纸（新华一号），分液漏斗四、实验材料与试剂扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物氨基酸混合液：0. 5%的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸的混合液（各组份浓度均为0. 5%）显色剂：0.1%水合年三铜正丁醇溶液五、实验操作取层析滤纸（20X2cm） 一条,在纸的一端距边缘3cm处用铅笔划一直线， 取其中点作为原点。在大试管中加入适当的扩展剂，使扩展剂的液面处于悬 挂在橡皮塞上的层析
5、滤纸的原点到底端的中间点样：用毛细管将氨基酸混合液点在原点上，用吹风机吹干，干后再点一次。 每次在纸上扩散的直径最大不超过3mm扩展：将点好样的层析滤纸悬挂于橡皮塞的钩子上，点样端的底边浸入扩展 剂约L5cnu保持大试管的垂直，待溶剂上升1520cm时取出滤纸，用铅笔 描出溶剂前沿界限，用吹风机热风吹干显色：用三角薄层喷瓶将01 %年三酮正丁醇溶液均匀地喷在风干的层析滤 纸条上，用热风吹干即可显出各层析斑点计算各种氨基酸的兄值六、注意事项为了防止滤纸被手上的汗液污染,应尽量在操作时带手套重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了黄三酮后的显色则要用热风吹 干滤纸2.血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、
6、实验目的/ 了解电泳技术的一般原理/学习醋酸纤维薄膜电泳的操作实原理二电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定 pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在 一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不 同，因此可使它们分离影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的PH值、溶液的离子强度和 电渗现象影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状按支持介质不同可将电泳分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳 和聚丙烯酰胺凝胶电泳另外，还可以按分离原理不同、支持介质形状不同、用途不同以及所用电压 不同等将电泳
7、分类电泳的装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽 中产生电场，驱动带电分子的迁移；电泳槽可以分为水平式和垂直式两类采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤 维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如: 丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维 素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 um,有很强的通透性, 对分子移动阻力很小醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、简便、 分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中
8、含有清蛋白、 a-球蛋白、球蛋白、丫-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基 酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤 维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8. 6的缓冲体系中电泳，染色后可显示 5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为al-、a 2-、8-及丫- 球蛋白三、实验器材醋酸纤维薄膜（2X8 cm）,常压电泳仪，点样器（盖玻片），培养皿， 粗滤，载玻片，镶子 四、实验材料与试剂兔血清（实验室制备），巴比妥缓冲液（PH8.6,离子强度0.07）, 染色液（氨基黑10B）,漂洗液五、实验操作浸泡：将2X8 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无
9、光泽面 距短边一端L5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平 皿中,浸泡30 min方可用于点样点样：用镶子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后 平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一载玻片上滴一滴血清，点样器（用 盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加 样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个 电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两 层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。 当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在
10、膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤 纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下）， 另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调 节电压至160 V,电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min染色：电泳完毕后将薄膜取下，放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽, 条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱清蛋白a 1- a 2- B - Y -球蛋白 原点六、注意事项市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的
11、关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳醋酸纤维素薄膜电泳常选用PH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为 0. 05-0. 09 mol/Lo选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过 低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢, 区带分布过于集中，不易分辨点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不 宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳 区带分离效果电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为
12、0.40.6mA/cm膜宽度。电 流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散操作过程为防止指纹污染，应戴手套七、实验思考用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？3.蛋白质的透析一、实验目的/ 了解透析技术的一般原理。/通过蛋白质透析实验掌握透析操作。二、实原理二透析是膜技术的一种，利用透析膜可以选择性的透过一定大小分子，从而将 待分离纯化的物质和杂质离子分离开。常见的透析有：蛋白质的透析和糖类的透析。透析是利用半透膜进行的一种选择性扩散操作，通常是将半透膜制成袋状， 将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液 中的
13、大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析 到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋(膜)外的溶液称 为“渗出液”或“透析液”。把需要透析的样品盛于透析袋内，袋内留有挤去空气的空余部分，以防由于 溶剂渗入造成样品体积增加而引起透析袋胀破。为了获得较快的透析速度，常常采取一些措施保持膜两侧浓度差具有最大 差，如经常更换透析外液，连续搅动外液。透析外液尽量不用纯水，常使用一定pH的低盐缓冲液，这样可以避免袋内 样品pH的变化和过分地稀释。透析袋出厂时都用10%的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一 些具有紫外吸收的杂质
14、，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须 除去。透析袋的处理:一般是将透析袋剪成1020cm的小段，在2%(W/V)NaHCO3 和Immol/L的EDTA (pH8.0)中煮沸lOmin,用蒸馈水彻底洗尽透析袋， 然后放在的EDTA (pH8.0)中煮沸lOmin,用蒸储水彻底洗尽透析袋，冷却后，存放于4P,从此时起取用透析袋，必须戴手套。检查透析效果的方法:用1% BaCh检查（NH4）2SO4,用l%AgNO3检查NaCl、 KC1 等。三、仪器、材料和试剂 磁力搅拌器（配搅拌子） 试管及试管架 透析袋（截留分子量10000） 蛋白质氯化钠溶液 3个除去卵黄的鸡蛋清与700mL水及
15、300mL饱和氯化钠溶液混合后，用数 层干纱布过滤。 10%硝酸溶液 1%确酸银溶液 1 %硫酸铜溶液 10%氢氧化钠溶液四、操作步骤1 .取1015mL蛋白质氯化钠溶液，装入处理好的透析袋中，夹紧两端，浸入 蒸馈水烧杯中进行12h的透析。2 .用硝酸银检测烧杯中透析液是否有氯离子存在？/ 121nL透析液+数滴10%硝酸溶液至酸性+ 1%硝酸银溶液3 .用双缩服法检测是否有蛋白质存在？/蛋白质溶液在碱性环境下与铜离子反应生成紫红色化合物4 .透析完全后，检测透析袋内是否存在蛋白质和氯离子？/注意：透析完全时，透析袋内会出现球蛋白沉淀，因为球蛋白不溶于纯水。 五、思考题1 .透析的一般原理是什
16、么？2 .蛋白质透析的用途有哪些？4.蛋白质的性质实验（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的/ 了解蛋白质的基本结构单位及主要连接方式/ 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理/学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理双缩服反应两分子尿素加热到180C左右时，生成双缩胭并放出一分子氮，双缩服在碱 性环境中能与CiP+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩以反应蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩朦相似，也能发生此反应，因此该反应 可用于蛋白质的定性或定量测定苛三酮反应所有的a -氨基酸及一切蛋白质都能和苗三酮反应生成蓝紫色物质，除了脯氨 酸、羟脯氨酸和荷三酮反应产生黄色物质该反应十分灵敏
17、，是一种常用的氨基酸定量测定方法该反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合苗三酮被还原成还原型黄三酮；第二步是所形成的还原型苗三酮结合另一分子水合 玮三酮和氨缩合生成有色物质黄色反应（Pauly反应）含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物 质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝酸酸钠多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化, 需加入少量浓硫酸才有黄色反应。考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝G-250具有红色和蓝色两种色调，在酸性溶液中其以游离态存在, 呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色考马斯亮蓝G-250染色
18、灵敏度比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2mhi左 右时间内达到平衡，室温lh内保持稳定在0.01LOmg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比，所以常用来 测定蛋白质的含量三、实验器材试管及试管架，试管夹，酒精灯，滴管，电炉，滤纸四、实验材料与试剂 尿素，10%NaOH溶液，1%CuSO4溶液，2%卵清蛋白溶液，0.5%甘氨 酸溶液，0.1%黄三酮水溶液，0黄三酮乙醇溶液，鸡蛋清溶液，头发， 指甲，05%苯酚溶液，浓硝酸，0.3%色氨酸溶液，0.3%酪氨酸溶液，考马 斯亮蓝G-250溶液五、实验操作双缩胭反应取少量尿素结晶，放入干燥的试管，微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始 硬化时停止
19、加热，尿素放出氮，形成双缩服冷却后，加入1mL 10%NaOH溶液，振荡混匀，再加入1滴1%CuSO4溶 液，振荡，观察实验现象向另一支试管中加入约1mL2%卵清蛋白溶液和约2mL 10%NaOH溶液,摇 匀，再加入2滴1%CuSO4溶液，随加随摇，观察实验现象 前三酮反应取2支试管，分别加入2%卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液各1mL,再各 加0.5mL 0.1%黄三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热l-2min,观察实验现 象在一块小滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，在原处滴一滴0.1%黄三 酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察实验现象：黄色反应（Pauly反应）取6支试管，按下表加入各试
20、剂：管号123456材料鸡蛋清溶液 1滴指甲少讦头发少许H5%若酚 溶液4滴0.3%色氨酸 溶液4滴0.3%酩氨 酸溶液4滴浓硝酸2滴5滴5滴4滴4滴4滴现象观察各管的现象，若反应较慢，可略微放置或用微火加热待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%NaOH溶液至碱性，观察颜色变化考马斯亮蓝反应取2支试管，按下表加入各试剂：剂管号鸡蛋清溶液(mL)蒸溜水(mL)考马斯亮蓝染色液 (mL)101520.10.95观察实验现象，并解释六、实验思考通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什 么？5.蛋白质的性质实验(二)蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、实验目的/ 了解蛋白质的两性解
21、离性质/学习测定蛋白质等电点的一种方法/加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识/ 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义/ 了解蛋白质变性与沉淀的关系二、实验原理蛋白质等电点测定蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：RCHCOOHINH.一R-CHCOOH 1+ 0卜, RCHCOO-1士 RCHCOO- 11+H，NH；NH；nh2阳离子氨基酸的兼性离子阴离子pH pI蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到 一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向 阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点（PI）。不同蛋白质各
22、有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化, 可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。我们测等电点最常用的方 法是测其溶解度最低时的溶液pH值本实验借观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用 醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值的缓冲液，向各缓冲液中加入酪蛋白后, 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。蛋白质的沉淀与变性在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水 胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉 淀蛋白质的沉淀可分为两类：（1）可逆的沉淀反应：蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起 沉淀的因素后
23、，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性 质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或低温下用乙醇（或丙酮）短时 间作用于蛋白质（2）不可逆的沉淀反应：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质 常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固, 蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应/注意：蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）， 并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白侦也未 必都已变性沉淀蛋白质的方法盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如硫酸铁，硫酸钠或氯化钠）, 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如
24、 球蛋白可在半饱和硫酸铁溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸镀溶液中析 出。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性，当除去盐后，即可溶解重金属盐沉淀法：当溶液pH大于蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带负电荷， 容易与重金属离子（Hg/ Pb*、C/或AgD结合成不溶性盐而沉淀。误服重 金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重 金属离子形成不溶性盐，然后再用催吐剂排出体外。某些有机酸沉淀法：某些有机酸指的是三氯乙酸、磺基水杨酸和硝酸等。当 溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与酸类的酸根负离子发 生反应生成不溶性盐而沉淀。有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇
25、、乙醇 或丙酮），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数，致使蛋白质颗粒容 易凝集而沉淀。此法如果控制在低温下操作并且缩短处理时间，则可使变性 速度减慢。加热变性标淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋 白质加热凝固，当蛋白质处于等电点时，加热变性凝固最完全和最迅速。加 热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然结构解 体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点，也破坏 了带电状态。古代人将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入大量盐卤(含MgCh) 制豆腐，便是此方法的成功应用。三、实验器材温度计，锥形瓶，恒温水浴锅，容量瓶，吸管，试管及试管架，乳钵四
26、、实验材料与试剂 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 lmol/L醋酸溶液 0. Imol/L醋酸溶液 0. 01mol/L醋酸溶液 蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液 0. 2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 3%硝酸银溶液 5%三氯乙酸溶液 95%乙醇 饱和硫酸镀溶液 硫酸钱结晶粉末 0.Imol/L盐酸溶液 0.lmol/L氢氧化钠溶液 0. 05mol/L碳酸钠溶液 甲基红溶液五、实验操作 等电点的测定 取同霖规格的4支试管，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀试管号蒸储水(mL)0.0lmol/L 醋酸 (mL)O.lmol/L 醋酸 GnL)1.0mol/L 醋酸 (mL)18.40.628.70.338147.41.6 振荡摇匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加8mL水，然后在第 2、3号管中各加1滴甲基红，再分别用0. lmol/L醋酸溶液及0. 05mol/L碳 酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成 每管再加0. lmol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀是是否再溶解。解释各管发生 的全部现象六、实验思考何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？ 详细记录各实验的结果和现象，并解释这些现象。