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1、如文档对您有帮助，欢迎下载支持，谢谢！西安地区汉族亚甲基四氢叶酸还原酶的两种基因多态性【关键词】 聚酶链反应【Abstract 】 AIM: To find out two genetic polymorphisms of MTHFR among the Han people in Xian area. METHODS: PCRRFLP technique was used to detect C677T and A1298C polymorphisms of MTHFR. RESULTS: The allele frequencies of 677T and 1298C were 45% a
2、nd 20%, respectively and the homozygote frequencies of 677TT and 1298CC were 18% and 3%, respectively. The frequence of combined heterozygosity for the C677T and A1298C mutations was 21%. CONCLUSIONT:he genetic polymorphism of MTHFRfrom our study is different from those previously reported by others
3、, which may due to differences between populations.【 Keywords】 RFLP; MTHFR; genes, polymorphism【摘要】目的：了解西安地区汉族人 MTHF匪因C677T和A1298c两个位点的遗传多态性.方法：应用聚合酶链反应限制性片 段长度多态性（PCRRFD查西安地区96个汉族人的基因型分布.结 果：677T等位基因的分布频率为45% TT纯合子占18% 1298c等位 基因的分布频率为20%. CCa子占3%双杂合子677CT, 1298AC占21%. 结论： 调查显示这两个位点的遗传多态性与文献报道不同， 可
4、能具有 群体差异性 .【关键词】 限制性片段长度多态性； 亚甲基四氢叶酸还原酶；基因，聚酶链反应0 引言亚甲基四氢叶酸还原酶（ 5， 10methylenetetrahydrofolatereductase , MTHFR 是人体内同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy ） 复甲基化的关键酶.由于MTHF塞因缺陷，造成该酶活性障碍，会影 响体内同型半胱氨酸的正常代谢， 使其血液浓度增高 1 . 而大量研 究表明，体内Hcy浓度每升高5 wmol・L-1 ,男、女患冠心病 的风险就会分别增加 1.6 和 1.8 倍 2 . 除此以外，高浓度的 Hcy 还是其他动静脉血栓形
5、成及神经管缺陷的致患因素 3 ， 4 . 经过十 余年的研究，现已发现人类 MTHFR勺15种点突变类型5.其中最 常见最重要的一个是第677位5T突变.此位点多态性不仅可以引起 酶活性下降，还与MTHFR勺热敏感Ti有关6,是上述疾病的易感因 子.A1298c是该基因的另一个常见多态位点，此点突变也影响酶的活 性， 但与热敏感性无关 4 . 不同国家和地区的多项研究表明， 人群中MTHFR!因C677T多态和A1298c多态的分布存在群体差异，这种差 异可能造成人群对疾病的易感性不同.本研究我们应用PCRRFL技术 检测这两处突变，了解西安地区汉族人MTHF塞因的分子遗传学特征.1 对象和方
6、法1.1 对象 200111/200206 间选取 96（ 男 58，女 38） 例，年龄3778（平土匀57.29）岁.互无血缘关系的汉族健康者，在西安地区长 期居住 （20 a 以上 ）.1.2 材料 DNAtt提试剂:STE液（10 mmol・L-1 Tris HCL,pH 8.0; 100 mmol・L-1 NaCl, 1 mmol・L-1 乙二胺四乙酸二钠(EDTA), 100 mL・L-1 Tween 20), TKM液(50mmol・L-1 Tris, pH 7.5;0.15 mol・L-1 KC
7、l; 5mmol・L-1 MgCl2) ， 100 g・ L-1 十二烷基磺酸钠 (SDS)，4 mol・L-1 NaCl, 无水乙醇， 700 mL・L-1 乙醇，饱和酚氯仿， TE 缓冲液( 10 mmol・L-1 Tris HCL, pH 8.0; 1mmol・L-1 EDTA) . PCRRFLP 试齐ij C677T 引物 P1: 5 TTTGAGGCTGACC TGAAGCACTTGAAGGA，GP2 ：5GACTGGTAGCCCTGGATGGGAAAG，ATAC1C2C9G8P3 ：CTTTGGG
8、GAGCTGAAGGAC TACTA C CACTTTGTGACCATTCCG GTTTG海生工合成）；4 xdNTPs, MgCl2, 10X Buffer, Taq酶（购自华美）； 限制性内切酶 Hinf I, Mbo H （日本 TaKaRa公司）；25g・L-1 琼脂糖和 200 mL・L-1 聚丙烯酰胺、溴化乙锭.主要仪器：PCRT增仪（PE公司，480型）等.1.3 方法1.3.1 酚氯仿法提取DNA采柠檬酸钠抗凝血 2 mL,用STE细胞裂解液使红细胞肿胀破裂，离心沉淀白细胞后，TKM重悬，依次加入SDS及NaCl破解白细胞，使蛋白析出，用饱和酚氯仿抽
9、提12次，取上清加冰无水乙醇使 DNA析出，12 000 g离心30 s后以700 mL・L-1乙醇洗去盐，晾干，最后用TE缓冲液（10 ： 1） 60止 L 溶解 DNA.1.3.2 PCRRFL砧检测基因型 C677T PC皈应体系25 L, 含 5 nmol・L-1 的引物，200 区 L・L-1 的 dNTP 25 mmol・L-1 MgCl2, 10X Buffer , 2 U Taq 聚合酶及 100 ng 基 因组 DNA.反应条件：95 c 5 min7 （95 C 30 s, 65 c 30 s, 72 c 15 s）
10、X35-72C 7 min.扩增产物长度为173 bp.限制性内切片段多 态性分析（RFLP）:总体积 10 wL,力口 4 U Hinf I 及 10X Buffer , 37 c 消化过夜，产物经 25 g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳条带，分析其基因型.A1298C: PCR反应体系25 wL,含5 nmol・L-1 的引物，200L・L-1 的 dNTPs, 25mmol・L-1 MgCl2, 10X Buffer , 2 U Taq 聚合酶及 100 ng 基 因组 DNA.反应条件：95 c 5min7 （95C
11、 30s, 55 C 30 s, 72 C 15 s） X35-72C 7 min. 扩增产物长度为163 bp. RFLP总体积10L,加4 U Mbo II及10 x Buffer , 37 c消化过夜，产物经 200 g・L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）电泳，澳化已锭染色后在紫 外灯下观察结果，分析其基因型.2 结果2.1MTHFRC677TR! MTHFRA1298寸增结果和基因型分析 MTHFRC677T增产物为 173 bp ,被 Hinfl 酶切成 128 bp 和 45 bp 2 条条带，根据此判断3种基因型，即纯合未突变 CC杂合CT和纯合 突变TT型；MT
12、HFRA1298C增产物为163 bp,无突变发生时，可以被 Mbo II酶切成56, 28, 31, 30 和18 bp 5条条带，突变后可产生 84, 31,30和18 bp 4条条带，据此将其基因型分为 AA AQ CC.2.2MTHFRC677T口 MTHFRA1298C因型的分布及其相互关联关系（Tab 1, 2）其中677T等位基因在人群中的分布频率为 45% 1298C等位基因在人群中的分布频率为20%，女性略低于男性，但不具有显著性差别 .表 1MTHFRC677T MTHFRA1298c因型的分布（略）Tab 1Distribution of MTHFRGenotype in
13、 Case and Controls（ 略）表2c677T和A1298c基因型之间关系的分布（略）Tab 2Relationship between MTHFR Genotype in C677T andA1298c （略）3 讨论MTHFR8因在人群分布呈遗传多态性，并按孟德尔常染色体隐性方式遗传. 欧洲人 677T 等位基因频率是24%-40%,日本人是26%-37%非洲美洲人约11% TT纯合子约占10%7; 1298c等位基因在人群中的发生率约 33%4,8 . 我们在对 96 例汉族人进行基因分型后发现，西安地区汉族人其 677T等位基因频率为45%, TT纯合子 占18%女性水平稍
14、低于男性（P>0.05 ） . 1298C等位基因占20%, 纯合子仅发现3例，均为男性，占总人数的3%. 677T等位基因及突变 纯合子TT频率高于日本人和非洲美洲人，但1298c等位基因频率却较 文献报道低，提示这两个位点存在基因多态性的群体变异，而且有可能和性别有一定的联系 . Van der Put 和 Weisberg 4,6 等认为突变等位基因677T和1298c在染色体上呈反式排列，即这两个突变等位基 因一般情况下不会同时存在于一条染色体上，并推测如果二者同时存在于一条染色体上，将对酶的活性产生较大影响. 所以 677 和 1298位点的突变具有明显的连锁不平衡性. 我们调
15、查了 96 例仅发现有1例呈677TT/1298AC这种双杂合子类型，占人群的1%与文献报道相 近 6 ，也符合上述推测.本实验建立了快速抽提 DNA勺方法，应用PCRRFL时MTHFR 的两个SNP行分析，可在两天内完成.此项方法不用放射性物质， 只需凝胶染色即可直接观察到基因型，避免了耗资、耗时的杂交及测序技术，已成为分析MTHFRI因多态性白常用方法.利用这一技术可 对人群进行MTHFRI因分型，为研究MTHFRI因多态性对北方汉族人 的影响，建立数据库. 同时为临床指导使用何种形式的叶酸增补剂来治疗高同型半胱氨酸血症提供了依据.【参考文献】 1 Moyers S, Bailey LB.
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