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1、谢谢您的观赏sars病毒论文流感病毒论文：RNA分子抗SARS病毒的应用和研究进展 严重急性呼 吸 综合征 (Severe acute respiratory syn-drome, SARS)又称传染性非典型肺炎，是一种严重急性呼吸系统传 染病，系由 SARS 相关冠状病毒 (Severe acute re-spiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV)引起的新发传染 病1。SARS-CoV是单股正链 RNA病毒，呈现典型冠状病毒 基因组结构特征：5-复制酶基因-S基因-E基因-M基因-N基 因-3以及5和3端非编码区2。SARS-Co
2、V侵入宿主 细胞后，首先以病毒基因组 RNA为模板，翻译自身RNA依赖 的RNA聚合酶，然后利用这种聚合酶完成病毒负链亚基因组 RNA转录、各结构蛋白的mRNA转录以及病毒基因组 RNA 复制等病毒粒增殖过程中的一系列环节3。目前SARS治疗的主要策略有广谱抗生素、抗病毒剂和免疫调制疗法，但是很 少的药物能够有效的对抗病毒 4,因而对抗SARS治疗而言, 改进治疗方案、开发更加特异性的药物和更有效的疗法十分 重要。基于核酸的基因调控分子是长度约20个碱基的人工合成性单链或双链 DNA或RNA,这些分子包括核酸配体、 反 义寡核甘酸、核酶和小干扰性RNA,这些分子以序列特异性方式针对细胞或病毒的
3、mRNA,造成靶mRNA断裂和/或阻断靶mRNA的转录与翻译起始，因此成为基因功能分析和抗病 毒药物开发的有力工具。本文就这些不同类型RNA分子在抗SARS病毒的应用及机制研究的进展进行综述。1 RNA适配子在抗SARS-CoV中的应用适配子(aptamer)是能与多种目标分子以高亲和力和高特异结 合的核酸序列，从原始文库中筛选与配体相对应的适配子的 技术称为指数级富集配体系统进化技术，即 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrich-ment)5-7。用于抗病毒的适配子是以病毒基因表达调 控有关的蛋白酶和关键基因作为主
4、要靶点，如SARS-CoV的3CL蛋白酶和 NTPase/解旋酶，还有双链 RNA/DNA 解旋、 RNA加帽活性中的关键基因均是理想的抗病毒靶点8。目前已经利用SELEX技术从多种文库中筛选到能够有效抑制 解旋酶活性的适配子。Jang等9筛选由针对SARS-CoV的 非结构蛋白nsP10的RNA适配子，可以有效抑制解旋酶的活 性。然而，天然RNA在体内的稳定性差，极易被体内各种 RNA 核酸酶降解，故难以在体内应用。Shum等10筛选到G-四倍 体和非G-四倍体两种构象的适配子。但是仅非G-四倍体能够特异性地抑制病毒解旋酶活性，而G-四倍体却不能。原因在于非G-四倍体经生物素或反向胸腺喀陡修
5、饰后在血清中 的稳定性增强，这种结构性选择及对稳定性的修饰作用为寻 找解旋酶适配子提供了新线索。适配子具有靶分子范围广、 亲和力和特异性高、稳定性好、制备方便等优点。随着对 SARS-CoV感染复制机制的深入研究以及核酸适配体技术的发展，一些有效且低毒的适配体分子被筛选由来，为抗SARS治疗带来了希望，但是核酸适配子易被体内的核酸酶降解，因此它的修饰，转移进细胞等方面也需要进一步研究。2 反义RNA在抗SARS-CoV中的应用反义寡核昔酸(Antisense oligonucleotide, ASON)指能够以碱 基配对方式与特定 DNA和RNA结合并阻止它们转录和翻译 的短核酸片段(反义链片
6、段)。反义RNA与mR-NA的特异性 互补结合可以抑制后者的翻译。最早于大肠杆菌的产肠杆菌 素的Col E1质粒中发现通过反义 RNA控制mRNA翻译，后 来许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA11 o就反义RNA抗病毒方面的研究而言，早在1978年就有报道表明反义 寡核甘酸可以抑制劳氏肉瘤病毒的复制12 o利用反义RNA能与特定的RNA病毒作用，直接抑制这些病 毒的复制，从而阻断RNA病毒的繁殖，达到抗病毒性疾病的目 的。ASON在抑制SARS-CoV蛋白表达的实际应用中，主要通 过化学修饰法来提高ASON的稳定性，体外试验证明硫代修饰的ASON能够下调 SARS-CoV结构蛋白E、M、
7、N的表达 量13。而3端修饰的ASON能够抑制SARS-CoV突起蛋 白(Spike Protein, SP)的mRNA的表达水平14。在抗病毒剂 中广泛研究的肽缀合反义吗咻代寡聚体(Peptide-conjugatedantisense morpholino oligomers, P-PMO)具有更强的反义作用 针对SARS-CoV 5 UTR中转录调控序列合成的P-PMO可以减少病毒诱导的细胞病理学并减慢病毒在细胞间的扩散15。利用与SARS-CoV种系关系很近的鼠科肝炎病毒 （MHV） 在体内建立感染模型，显示与MHV病毒基因组RNA5 端配 对的P-PMO可以减少病毒复制和小鼠组织损伤
8、，但是这种P-PMO也具有潜在毒性16。Krahling等用磷酰二胺吗咻修 饰的PPMO可以抑制细胞凋亡17 o而感染细胞的抗凋亡水 平的升高能够减少细胞的自杀现象18。反义核酸技术原理简单、前景诱人，在基础研究及抗病毒的研究中都显示由很大 的优势和潜力，在抗SARS的治疗中也有潜在的应用价值，但 在实际使用中还存在一些不容忽视的问题，如许多ASONs缺乏特异性且具有免疫刺激性和激活补体的毒副作用，这些都需要我们寻找更有效的途径来改造和更新原有的思路，才能使它作为分子药物不断深入的研究。3 核酶在抗SARS-CoV中的应用核酶是一类本身具有酶剪切活性的RNA,能够以序列特异性方式催化靶RNA的
9、切割。迄今发现的核酶从结构上主要分 为两大类：锤头型核酶和发夹型核酶。核酶与反义RNA不同,它们具有催化活性，无免疫原性，在应用上可能比反义药物具 有更大的潜力，因此越来越广泛地应用于基因研究与治疗各 领域。体内和体外实验已经证明了核酶可以抑制HIV、HBV、HCV病毒的复制，近几年也逐渐开始了动物水平的评价，已经批准核酶在抗HIV和癌症方面进行临床试验19-21 oMizutani等报道了核酶与同源于 SARS-CoV的病毒MHV的相互作用，其中与MHV基因组RNA的5端结合的核酶能够 抑制MHV 增殖22。Maeda等合成了与 MHV 的RNA聚合 酶特异结合的两种锤头型核酶：S-核酶和L
10、-核酶，能够使感染的子代病毒颗粒大量减少，尽管S-核酶剪切RNA的过程比L- 核酶慢，但是这两种核酶的作用效果是相同的23,24 o然而,如何获得高效、无毒的特异性核酶，如何选择靶序列中最佳切 割位点，如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等 问题对核酶今后的应用和发展提由了新的挑战。因此，不断采取新的设计策略，提高核酶的切割效率，通过人工筛选或修饰 手段构建新的人工核酶并扩大核酶催化反应谱将成为核酶 研究的主要内容之一。 虽然核酶抗SARS-CoV的作用仍在研 究中,至今还没有明确结果，但是通过研究它对 SARS-CoV种 系很近的病毒的作用，可以推测核酶在抗SARS-CoV基因治疗中的
11、潜在效果，为预防和治疗 SARS又开拓了一条可行之 路，很可能成为未来抗病毒研究的热点。4 siRNA在抗SARS-CoV中的应用 RNAi(RNA interference, RNAi)最早在研究秀丽新小杆线虫 (C elegans)反义RNA的过程中发现25。在生物体内，双链 RNA 被核糖核酸酶切割成长度21-23nt的小干扰性 RNA(small interfering RNA, siRNA), 它能与特定 mR-NA 结合 引起其降解而导致基因沉默。有关报道显示,siR-NA在细胞和动物水平均可以有效抑制病毒复制26,27 o siRNA 比ASON具有更强的优势和潜力，为研究抗SA
12、RS病毒感染过程 提供了新的研究工具并且已成为当前的研究热点之一。众多研究者确定了针对SARS-CoV基因组的siRNA作用的不同靶位点，并在体外实验和动物实验中利用这些靶位点通 过RNAi方法展示了高效的抗病毒作用。在体外细胞实验中 证实与SARS-CoV的S蛋白特异结合的 siRNA能够降低S 蛋白的表达，并且在动物实验中证明siRNA的作用能够减轻发病症状28,29 o目前广泛应用化学合成和重组质粒法产生 siRNA o以病毒RNA聚合酶基因为靶点的 siR-NA重组表达 质粒转入细胞后能够降低病毒RNA和病毒蛋白的表达水平，从而抑制病毒复制30。与SARS-CoV的非结构蛋白 NSP1
13、 序列特异性结合的质粒表达型siRNA可以使感染后的细胞病变减轻、活细胞显著增加、病毒空斑明显减少31。化学合成法因其合成效率更高，吸引了更多研究者的关注。由于对 靶基因不同部位的 siRNA具有不同的干扰效率，故需要对设 计的siRNA进行筛选。Zheng32等从化学合成法产生的 48 条针对SARS-CoV基因组中各基因编码区的 siRNA筛选到4 种有效抑制靶基因的分子 ，并且联合应用可以显著提高对靶 基因表达的抑制效应。同样，Shi等化学合成针对 SARS-CoV 中E、M和N蛋白基因的siRNA能使各个靶基因的表达水 平降低80%33 o Wu等合成的针对SARS-CoV前导序列、
14、TRS、 5 -UTR和SP序列的siRNA能够抑制 SARS-CoV复制34。同时，体外实验证实了针对 SARS-CoV前导序列的 siRNA的抑制强度高于针对 S基因的siRNA和反义寡核昔酸 35,这两组结果说明前导序列可以作为有效靶点。尽管众多 研究以病毒基因组中的全长ORF作为研究SARS-CoV病毒复制的主要对象，但是实验证明亚基因组 RNAs(subgeomic RNA,sgRNA)对病毒的复制增殖也很重要。以 SARS-CoV sgRNA设计的siR-NA能够抑制病毒蛋白的表达，使子代病毒 的增殖明显减少36 o在RNAi作用过程中，siRNA的稳定性 和特异性很重要。利用具有
15、高亲和力的核昔酸类似物-锁定核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)修饰siRNA后,使其在血清中 的稳定性大大提高，并且对靶基因作用效率高于未修饰的 siRNA37 o siRNA逐渐成为抗病毒治疗研究领域的热门工 具，为开发可以预防和治疗 SARS的潜在药物创造了条件。 在 siRNA的应用过程中，怎样设计由有效的 siRNA序列,如何有 效地将siRNA分子有效的转移到靶器官并进入靶细胞，怎样提高siRNA的稳定性等问题还需解决。但是关于siRNA的许多研究结果使大家深信 ,siRNA是非常有希望被应用于临 床的。5结语已知新型冠状病毒 SARS-CoV是引起严重急性呼吸
16、道综合 征(SARS)的病原体，目前尚无有效的针对性预防和治疗药物。随着分子生物学的进展，基因治疗成为新的抗病毒策略。RNA谢谢您的观赏谢谢您的观赏相关的抗病毒策略能够针对病毒基因组而对宿主的影响较小，因而在近期的抗 SARA治疗中得到广泛关注，也取得了很 大的进展。SARS-CoV基因组测序已经完成，对病毒的分子生 物学特性有了一定了解，针对病毒复制、增殖相关的主要序列 为靶点设计的 RNA适配分子、反义核酸、核酶、 siRNA能 够有效的抑制 SARS-CoV的复制，现在成为医学和生物学研 究的前沿和热点。本文主要阐述了RNA相关分子抗病毒机制取得的一些最新进展，国内外的科学家合成筛选由很
17、多基 于RNA的基因调控分子，体内体外实验均有抗 SARS病毒的 作用。但是这些相关技术仍然需要克服核酸类化合物的固有 限制性，如将合成的目的序列导入细胞的方法、在细胞内的稳定性、如何避免脱靶现象和非特异性反应以及获得高疗效 等。尽管还有很多工作要做，但是这些RNA相关生物技术的 研究结果已经显示了诱人的前景，为研究抗SARS病毒药物 提供了可行性，具有广阔的应用前景和临床实用价值。参考文献：1 Marra M A, Jones S J, Astell C R, et al The genomesequence of the SARS associated coronavirusJ. Sci-
18、ence, 2003, 300(5624): 1399-1404.2 Paul A, Rota M, Steven O, Stephan S, et al. Charac-terization of a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory SyndromeJ. Science, 2003, 谢谢您的观赏谢谢您的观赏300(5624): 1394-1399.3芮伟，张其鹏，石磊，等.SARS冠状病毒RNA聚合酶编码区 分析.北京大学学报(医学版)(Rui W, Zhang QP, Shi L, et al.Analy
19、sis of coding region in RNA poly-merase of SARS-CoVJ. Peking Univ (Heal Sci),2003, 35: 137-138.4 Stockman L J, Bellamy R, Garner P. SARS: systematicreview of treatment effectsJ. PLoS Med, 2006, 3(9),e3435 Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by ex-ponential enrichment: RNA ligands to bac
20、teriophage T4DNA polymeraseJ. Science, 1990, 249: 505-510.6 Ellington A D, Szostak J W.In vitroselection of RNAmolecules that bind specific ligandsJ. Nature, 1990,346: 818-822.7 Jayasena S D. Aptamers: an emerging class of moleculesthat rival antibodies in diagnostics J. Clin Chem,1999, 45: 1628-165
21、0.8 Thiel V, Ivanov K A, Putics A, et al. Mechanisms andenzymes involved in SARS coronavirus genome expres-sionJ. J Gen Virol, 2003, 84(9): 2305-2315.9 Jang K J, Lee N R, Yeo W S, et al. Isolation of inhibi-tory RNA aptamers against severe acute respiratory syn-drome(SARS) coronavirus NTPase/Helicas
22、eJ. Bio-chem Biophys Res Commun, 2008, 366(3):738-744.10 Shum K T, Tanner J A. Differential inhibitory activi-ties and stabilisation of DNA aptamers against theSARS coronavirus helicaseJ. Chembiochem, 2008, 9(18): 3037-3045.11 Tomizawa J, Itoh T, Selzer G, et al. Inhibition ofColE1 RNA primer format
23、ion by a plasmid-specifiedsmall RNAJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981, 78(3): 1421-1425.12 Zamecnik P C, Stephenson M L. Inhibition of Roussarcoma virus replication and cell transformation by aspecific oligodeoxynucleotideJ. Proc Natl Acad SciUSA, 1978, 75(1): 280-284.13 Shi Y, Luo H, Jia J, et al. A
24、ntisense downregulationof SARS-CoV gene expression in Vero E6 cellsJ. JGene Med, 2005, 7(1): 97-10714 Wang Z, Shi J, Jin H, et al. Properties of isonucleoti-de-incorporated oligodeoxynucleotides and inhibition ofthe expression of spike protein of SARS-CoVJ. Bio-conjug Chem, 2005, 16(5):1081-1087.15
25、Neuman B W, Stein D A, Kroeker A D, et al. Inhibi-tion, escape, and attenuated growth of severe acute re-spiratory syndrome coronavirus treated with antisensemorpholino oligomers J. J Virol, 2005, 79 (15):9665-9676.16 Neuman B W, Stein D A, Kroeker A D, et al. Inhibi-tion and escape of SARS-CoV trea
26、ted with antisensemorpholino oligomersJ. Adv Exp Med Biol, 2006,581: 567-571.17 Krahling V, Stein D A, Spiegel M, et al. Severe acuterespiratory syndrome coronavirus triggers apoptosis viaprotein kinase R but is resistant to its antiviral activityJ. J Virol, 2009, 83(5): 2298-2309.18 Parris G E. Hyp
27、othesis links emergence of chloro-quine-resistant malaria and other intracellular patho-gens and suggests a new strategy for treatment of dis-eases caused by intracellular parasitesJ. Med Hypot-heses, 2004, 62(3): 354-35719 Alessio P. Prospects for antiviral ribozymes and de-oxyribozymesJ. Rev. Med,
28、 Virol, 2004, 14: 47-64.20 Jon E. Chatterton, Hu X Y, et al. Ribozymes in geneidentification, target validation and drug discoveryJ.Targets, 2004, 3(1): 10-17.21 Khan A U. Ribozyme: A clinical toolJ. ClinicaChimica Acta, 2006, 367: 20-27.22 Mizutani T, Hayashi M, Maeda A, et al. Inhibition ofmouse h
29、epatitis virus multiplication by antisense oligo-nucleotide, antisense RNA, sense RNA and ribozymeJ. Adv Exp Med Biol, 1993, 342: 129-135.23 Maeda A, Mizutani T, Hayashi M, et al. Inhibition ofviral multiplication by hammerhead ribozymes targetedagainst the polymerase gene of mouse hepatitis virusJ.
30、 J Vet Med Sci, 1994, 56(5): 939-945.24 Maeda A, Mizutani T, Hayashi M, et al. Inhibition ofviral multiplication in acute and chronic stages of infec-tion by ribozymes targeted against the polymerase geneof mouse hepatitis virusJ. Adv Exp Med Biol, 1995,380: 399-404.25 Wilkins C, Dishongh R, Moore S
31、 C, et al. RNA inter-ference is an antiviral defence mechanism in Caenorhab-ditis elegans. Nature, 2005, 436(7053): 1044-1047.26 Park W S, Miyano-Kurosaki N, Hayafune M, et al.Prevention of HIV-1 infection in human peripheralblood mononuclear cells by specific RNA interference. NucleicAcids Res, 200
32、2, 30(22): 4830-4835.27 McCaffrey A P, Nakai H, Pandey K,et al. Inhibitionof hepatitis B virus in mice by RNA interference. NatBiotechnol, 2003, 21(6): 639-644.28 Zhang Y, Li T, Fu L, et al. Silencing SARS-CoVSpike protein expression in cultured cells by RNA in-terferenceJ.FEBS Lett. 2004, 560(1-3):
33、 141-146.29 Li B J, Tang Q, Cheng D, et al. Using siRNA inprophylactic and therapeutic regimens against SARScoronavirus in Rhesus macaqueJ. Nat Med, 2005,11(9): 944-951.30 Wang Z, Ren L, Zhao X, et al. Inhibition of severe a-cute respiratory syndrome virus replication by small in-terfering RNAs in m
34、ammalian cellsJ. J Virol, 2004,78(14): 7523-7527.31 Ni B, Shi X, Li Y, et al. Inhibition of replication andinfection of severe acute respiratory syndrome-associat-ed coronavirus with plasmid-mediated interferenceRNAJ. Antivir Ther, 2005, 10(4): 527-533.32 Zheng B J, Guan Y, Tang Q, et al. Prophylact
35、ic andtherapeutic effects of small interfering RNA targetingSARS-coronavirusJ. Antivir Ther, 2004, 9(3): 365-374.33 Shi Y, Yang D H, Xiong J, et al. Inhibition of genesexpression of SARS coronavirus by synthetic small in-terfering RNAsJ. Cell Res, 2005, 15(3): 193-200.34 Wu C J, Huang H W, Liu C Y,
36、et al. Inhibition ofSARS-CoV replication by siRNAJ. Antiviral Res,2005, 65(1): 45-48.35 Li T, Zhang Y, Fu L, et al. siRNA targeting the lead-er sequence of SARS-CoV inhibits virus replicationJ.Gene Ther, 2005, 12(9): 751-761.36 Akerstr m S, Mirazimi A, Tan Y J. Inhibition ofSARS-CoV replication cycle by small interferenceRNAs silencing specific SARS proteins, 7a/7b, 3a/3band SJ. Antiviral Res, 2007, 73(3): 219-227.37 Elm en J, Thonberg H, Ljungberg K, et al. Lockednucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNAstability and functionality J. Nucleic Acids Res,2005, 33(1): 439-447.谢谢您的观赏