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1、不同生长年限白芍中主要成分含量的比较研究Comparison of the contents of major ingredients in Radix paeoniae alba with different growth phases MA Fujia1*， CANG Jie1*， KONG Ming 2，3， LI Songlin 2，3（1. Department of Pharmacy， No. 455 Hospital of PLA， Shanghai 200052， China； 2. Nanjing Integrated Traditional Chinese Western
2、Medicine Hospital， Nanjing 210028， China； 3. Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine， Nanjing 210028， China） ABSTRACT Objective： To compare the contents of major ingredients in Radix paeoniae alba with different growth phases. Methods： The contents of gallic acid， oxypaeoniflorin， albiflorin，
3、 peoniflorin， benzoic acid and 1，2，3，4，6-pentagalloylglucose from Radix paeoniae alba with 2 5 years of growth phases were determined by HPLC so as to provide a scientific evidence for the planting and harvest of Radix paeoniae alba. Results： The contents of gallic acid and benzoic acid were gradual
4、ly decreased while the contents of oxypaeoniflorin， albiflorin， peoniflorin and 1，2，3，4，6-pentagalloylglucose increased with the increase of its growth phase. Conclusion： The contents of active ingredients in Radix paeoniae alba with 45 years of growth phase are the highest， suggesting it is the mos
5、t suitable time for harvest. KEY WORDS Radix paeoniae alba； HPLC； growth phase 白芍为毛茛科植物芍药（Paeonialactiflora pall）的干燥根，主产于安徽亳州、浙江磐安等地，具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳的功效，可用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，胁痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕1。白芍的主要活性成分为单萜糖苷类成分，如氧化芍药苷、 芍药内酯苷、芍药苷等，具有显著的镇痛、抗炎等作用；没食子酸类成分，如没食子酸、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖等，具有明确的抗氧化、抗炎等作用2；酚类成分，
6、如苯甲酸，通常被认为是食品中的有害成分，但通过对苯甲酸累积规律的研究，可间接评价白芍的质量3。白芍为多年生草本，一般夏、秋二季采挖。有文献显示，不同生长年限对白芍质量存在影响2-4，但这些研究均以芍药苷作为单一评价指标，缺乏整体性。调研表明，白芍尚未明确具体的采收年限，但产地一般采挖生长周期为35年的白芍根，绝大多数市售白芍中芍药苷的指标均能满足药典芍药苷含量不小于1.6%的要求1，但其活性成分随着生长年限而变化的规律仍不清楚，还需深入探讨。本研究通过建立白芍中6个主要活性成分含量测定的方法3，5-9，以此探讨白芍主要活性成分含量和生长年限的相关性，为白芍规范化种植采收提供科学依据。 1 材料
7、与方法 1.1 仪器与试药 Waters 高效液相色谱仪（Alliance 2695 四元泵、自动进样系统、柱温箱、Empower色谱工作站、Waters 996二极管阵列检测器）；Millipore Milli-Q超纯水仪（美国）；Mettler 万分之一及百万分之一电子天平（瑞士）。 1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖和氧化芍药苷购自四川维克奇生物科技有限公司；芍药苷（110736 - 201337）和没食子酸（110831 - 201204）购自中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷自制，结构经NMR和MS确证，纯度经HPLC测定大于98%；鲜白芍药材购自安徽省亳州市五马镇，经江苏省中医药
8、研究院鉴定为毛茛科植物芍药（Paeonialactiflora pall ）的根。甲醇，乙腈为色谱纯，其余均为分析纯。 1.2 色谱条件 色谱柱：Alltima C18（4.6 mm250 mm，5 mm）柱温：35 ；流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸，梯度洗脱如下：020 min，A：5%10%；2040 min，A：10%20%；4050 min，A：20%50%；流速：1 ml/min；进样量20 ml；检测波长：230 nm。 1.3 对照品溶液的配制 精密称取没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸和1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖对照品适量，加甲醇制成每1 ml含没食
9、子酸0.142 5 mg、氧化芍药苷0.181 5 mg、芍药内酯苷0.849 0 mg、芍药苷1.440 0 mg、苯甲酸0.165 0 mg和1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖0.813 0 mg的混合对照品母液。 1.4 供试品溶液的制备 取白芍鲜药材，粉碎，取细粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 ml，超声提取45 min，静置，补足重量，取上清液微孔滤膜（0.45 mm）滤过， HPLC测定。另取适量白芍鲜药材，按2015版中国药典四部通则0832水分测定法第二法测定，药材含量以扣除水分后的干品计算。 1.5 线性关系的考察 取混合对照品母液稀释成不同浓度，各精密
10、吸取20 ml，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下进行分析，记录色谱峰面积。 1.7 精密度实验 取混合对照品溶液重复进样6次，每次10 ml，计算其峰面积的RSD值；另取混合对照品溶液10 ml进样，每小时进样1 次，连续进样6 次，计算日内精密度；连续 3 d 进样以上浓度的对照品溶液，每天进3次，计算日间精密度。 1.8 重现性实验 取3年生鲜白芍药材6份，按“1.3”项下确定的方法制备供试品溶液，计算没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖含量的RSD值。 1.8 稳定性实验 取3年生鲜白芍药材1份，按“1.3”项下确定的方法制备供试品溶
11、液，于0、2、4、6、8、10、12 h依法测定，计算没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD值。 1.9 加样回收率实验 称取已知含量的3年生白芍药材6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入含0.25 mg/ml没食子酸，0.12 mg/ml氧化芍药苷，6.08 mg/ml芍药内酯苷，11.86 mg/ml芍药苷，2.30 mg/ml苯甲酸，3.57 mg/ml 1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖对照品溶液0.8 ml，1.0 ml，1.2 ml各2份，按“2.3”项下的方法操作，依法测定，计算它们各自的回收率。 1.10 样品
12、含量测定 取不同生长年限的鲜白芍药材，按1.3项下方法，制备供试品溶液，每个样品平行3份，计算没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖的含量。 2 结果 2.1 色谱条件 在所列色谱条件下，供试品溶液中6个对照品与相邻成分基本达到基线分离（图1）。 2.2 线性关系的考察 以对照品浓度X与对应的峰面积Y 作线性回归，回归方程、线性范围和相关系数见表1。 2.3 精密度实验 没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为1.9%、1.5%、1.7%、0.9%、1.2%、1.5%，表明仪器精密
13、度良好；日内精密度RSD（ n =6） 分别为1.3%、1.4%、2.0%、1.1%、1.3%、0.7%；日间精密度RSD （ n = 9） 分别为1.9%、1.9%、1.5%、0.7%、1.1%、0.9%。日内、日间精密度RSD 均2.0%，表明该方法的日内和日间精密度均良好。 2.4 重现性实验 6份供试品溶液中没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖含量RSD分别为2.5%、2.6%、1.8%、2.2%、3.1%、2.9%，重复性结果良好。 2.5 稳定性实验 供试品溶液中没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-
14、五没食子酰葡萄糖含量在12 h内稳定性RSD分别为3.1%、2.1%、2.8%、1.9%、2.2%、2.6%，表明供试品溶液在12 h内稳定。 2.6 加样回收率实验 没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖的回收率及RSD见表2。 2.7 样品含量测定 不同生长年限的鲜白芍药材主要化合物含量（表3）。 3 讨论 3.1 样品采集 为避免不同种植地、不同采收时间存在的差异，本试验所用药材为同一种植地、同一品种、同一采收时间的不同生长年限鲜白芍，以减少试验误差。 3.2 流动相的选择 试验中分别考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水3中不同的
15、流动相及其不同比例对6个主要化合物的分离效果，结果显示，在乙腈-0.1%磷酸水条件下，采用选定的梯度洗脱条件可以达到6个成分基线分离，且分离度大于1.5。 3.3 检测波长的确定 试验中采用了二极管阵列检测器，在分析对照品的同时进行了190400 nm全波长紫外扫描，结果显示没食子酸，氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖的最大吸收波长分别为278、258、230、230、230和278 nm。实验中分别提取258、230和278 nm下各样品溶液的色谱峰进行比较，结果在230 nm下的各成分峰形好，基线平稳，各色谱峰之间的分离度高，故检测波长选定为230
16、 nm。 3.4 提取条件的确定 试验中设计比较了甲醇、70%甲醇回流提取和甲醇、70%甲醇超声提取对测定结果的影响。结果显示，回流提取可使没食子酸含量明显增加，根据文献报道没食子酸和甲醇能在催化作用下形成没食子酸甲酯8，因此，我们认为回流提取由于加热温度过高，使得药材中没食子酸发生加成反应，生成没食子酸甲酯，故选定70%甲醇超声提取。 另外，对超声提取时间进行了考察，分别比较了提取30、45 和60 min时6个化合物的含量及其总含量，结果显示，在超声提取45 min时6个化合物的含量已达最高，最终确定采用70%甲醇超声提取45 min。所建的方法经过方法学考察验证表明，该方法操作方便、稳定
17、、可行。 3.5 不同采收期对各成分含量的影响 实验中考察了从2年至5年不同生长年限的鲜白芍主要化学成分的含量。结果显示没食子酸和苯甲酸含量随着生长年限的增加逐渐下降，尤其是苯甲酸含量从8.432 mg/g下降至0.785 mg/g。根据文献报道显示苯甲酸主要分布于白芍外皮中，推测生长年限少的白芍较细，外皮所占重量比例较高，因此苯甲酸的含量较高，该研究结果与文献报道较一致6。白芍中的主要活性成分包括单萜糖苷类和没食子葡萄糖类，其中含量较高的最主要化合物为芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷和1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖，这些化合物的含量随着生长年限的增加而增加，均为5年生4年生3年生2年生。中国药典以芍药苷为指标控制白芍质量，要求芍药苷含量大于1.6%。从研究结果来看，25年生白芍芍药苷含量从0.74%逐年升高至1.97%，而2年、3年生白芍芍药苷含量均低于1.6%，尚未达到药典要求，因此，为满足药典要求，白芍宜采挖45年生为主9-10。调研显示产地一般于夏、秋二季采挖45年生白芍，洗净，除去头尾和细根，置水中煮沸后除去外皮或去皮后再煮沸、晒干。因此， 由于45年生的白芍有效成分含量最高，比较适宜采收。本实验所测数据为确认白芍最佳采收期提供了依据，便于更好地控制药材的质量。