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1、一、活细胞的观察检测方法,肉眼观察 相差显微镜观察,细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。 细胞常规检查的方法为：,肉眼观察,一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。,pH 颜色 透明度,正常 7.27.4 桃红色 清亮、透明 酸性产物 变浅、变黄 污染 混浊,变黄 pH pH 变红,生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。 若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞
2、形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。,显微镜观察,细胞的生长状态,BMSC (bone marrow stromal cells 骨髓基质细胞 ),Anip973 （肺癌细胞）,二、细胞计数,计数方法有 血细胞计数板人工计数； 细胞计数器自动计数法,三、细胞生长曲线,细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标,可用来分析细胞的增殖速度，确定细胞进行传代及冻存操作的最佳时间。,How to make cell growth curve?,1.培养细胞 首先在培养板的21个孔内分别接种相同数量的细胞。
3、计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0h,2.计数细胞密度 每隔24h计数3孔(瓶)内的细胞密度，算出平均值。如此操作至第七天结束。,3.绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得,四、体外活体染色观察,体外活体染色是在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动方法。 原理：一般的生物材料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后，细胞膜被破坏，染料才能进入细胞内部。但活体染料却能进入活细胞，它们是一些无毒或毒性很小的染色剂，能使细胞中某些特定结构着色。活体染料基本上不影响细胞的生命活动。,1.活体染料的类别 碱性活体染料：詹纳斯绿
4、，中性红，次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等 酸性活体染料：台盼蓝，刚果红,体外活体染色使用碱性活体染料（带正电）,2.台盼蓝排除检测法 (1)0.4台盼蓝溶液的配制： 称取0.4g台盼蓝(trypan blue)，加少量双蒸水研磨粉碎后，再加水至50m1，离心后取上清液，再加入1.8NaCl溶液至100ml，即成。,染色步骤 1)吸去培养液，洗涤。 2)加入活体染料，2min后观察。,3)在显微镜下观察 4)倾去染液。洗涤。 5)加入培养液。继续培养。,活细胞染料排除检测法,由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入而使细胞呈色。 镜下，死细胞呈淡蓝色，活细胞不染色。,注意事项: 细胞
5、悬液放置时间过长,正常细胞可摄取染料,从而影响染色结果,一.填空题 1血细胞计数板：有不同的型号，常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)血细胞计数板。纽巴氏血细胞计数板有两个计算室，各室划分为-个大格，每个大格的平均面积为-。计算室上方盖上血细胞计数板专用的盖玻片后，室的深度则为-mm。用于血细胞计数时，白细胞用-，红细胞用-。 2体外活体染色就是在-条件下用某种染色剂对-进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。 二.名词解释 细胞生长曲线 三.简答题 1简述制作细胞生长曲线的过程。 2简述活体染料的染色步骤 3简述活细胞的染料排除检测法的原理及台盼蓝排除检测法的操作过程 4简述用细胞计数板计数细胞的操作程序及注意事项：,