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1、,补充：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片段，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落),不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列
2、中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,2.真核细胞的基因结构,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白
3、质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,1、从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,（1）.基因文库,某生物体内全部DNA,许多
4、DNA片段,受体菌群体,1、从基因文库中获取目的基因,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库 （cDNA文库）,基因组文库的构建,（2）.基因文库的构建方法,通过对受体菌的培养而储存基因, cDNA文库的构建-反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,（3）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸
5、序列的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,直接分离法(鸟枪法), 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _.,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,2、利用PCR技术扩增目的基因,过程：,
6、a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,过程：,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制
7、,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,1.作用：,二. 基因表达载体的构建-核心,IMN,2.组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。,同时使目的基因能表达和发挥作用。,(3)终止子：是使转录在需要的地方停止,(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因
8、的细胞筛选出来,(2)启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位,(1)目的基因,不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。,（5）复制原点：是转录和复制的起点。,二、基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口 两个黏性末端,复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因,寻根问底：,将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体
9、的构建。,这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。,资 料:,科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。,然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资料证明：表达载体构建组成要完整,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子
10、三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,2.下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,3. 在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对
11、，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）个,A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 7560,4.目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A B C D,5.（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,D,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三.目的基因导入受体细胞,转化：
12、,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,特点:,农杆菌转化法：,（1）将目的基因导入植物细胞,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力,过程：,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,适用生物：,双子叶植物、祼子植物。,Hin d限制性酶,目的DNA,Ti质粒,苏云金杆菌,构建表达载体,Bt毒素蛋白基因,DNA连接酶,T-DNA (可转移-DNA),知识拓展,农杆菌转化法的过程：,基因枪法：,利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单
13、子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。,适用：单子叶植物,适用于 单子叶植物,基因枪法,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,花粉管通道法,适用于 被子植物,细胞类型：,操作程序：,_显微注射法：,（2）将目的基因导入动物细胞,发育成新性状动物,移植到子宫或输卵管,培养成早期胚胎,显微注射,取受精卵（体内或体外 受精）,提纯含目的基因表
14、达载体,受精卵,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌,Ca2+处理获得感受态细胞,Ca2+处理 大肠杆菌,感 受 态 细 胞,表达载体 与感受态 细胞混合,感受态细胞 吸收DNA,_感受态细胞法,（3）将目的基因导入微生物细胞,（3）.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化
15、过程. 第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,四 目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组 DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持 和表达？,不一定，需要检测,1.检测方法：,分子杂交技术：,（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交,（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交,（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交,2.个体生物学水平的鉴定：,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,1.检测,转基因生 物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（
16、1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法：,DNA分子杂交技术,变性,变性,DNA分子杂交原理：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针和转基因生物的DNA杂交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置可以看见），则说明目的基因已插入受体细胞的染色体DNA中。,基因探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。,变性,方法：,DNA分子杂交技术,（2）检测目的
17、基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物 的mRNA,14N,14N,如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法：抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2.鉴定个体生物学水平的鉴定,（1）多细胞个体,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,不能，受体细
18、胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,（2）单细胞生物,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成,复制原点 + 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法,DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术,分子检测外的个体水平鉴定,