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1、魔芋的组织培养和工厂化生产技术魔芋(Amorphophallus konjac)为天南星科多年生草本植物，因其是世界上唯一高含葡甘聚糖的植物而在近些年来引起人们的广泛关注。目前全世界魔芋属植物约130种，中国境内被记载的有21种，其中经济价值较高的栽培品种主要有花魔芋和白魔芋，在我国种植面积较大的地区在鄂西山区、四川盆地、秦岭以南的汉中盆地周围海拔2502500 m的山区，以及云贵高原海拔12502300 m的中山山地。魔芋分布的海拔区间，因品种的不同和地区差异而有所不同，20世纪90年代，西南农业大学的刘佩英教授主持选育了第一个魔芋品种“万源花魔芋”，2003年，恩施州农科院魔芋研究所选育并
2、鉴定了第二个魔芋新品种“清江花魔芋”。我国魔芋的组织培养技术研究报道始于20世纪90年代中期，其间经历了试管苗、试管芋和脱毒原原种生产等几个阶段，魔芋的品种不同，生长的自然环境不同，需要采用不同的组织培养条件和工厂化生产技术，针对不同地区的不同魔芋品种，国内多家科研单位进行了研究。 1 试管苗生产技术 魔芋组培试管苗的研究报道最早见于1986年，孔凡伦等研究了白魔芋的组织培养和植株再生技术，其愈伤组织诱导培养基为MS+BAl0 mgL-1+NAAl0 mgL-1，继代培养基为MS+BAl0 mgL-1+NAA01 mgL-1，芽分化培养基为MS+ KT4O mgL-1+NAA05 mgL-1；
3、华中农业大学农学系张征兰、黄连超等人采用魔芋幼芽和幼嫩芽鞘，经体积分数01升汞灭菌20 rain后，接种在 MS+BA06 mgL-1+NAA06 mgL-1的培养基中，在室温25l、光照9 hd的条件下培养3周，形成愈伤组织，愈伤组织转入MS+BA40 mgL-1+IBA025 mgL-1+GA，3 mgL-1的分化培养基上，4周分化出芽和白色地下茎，其分化率为40，再转移至MS+BA20 mgL-1+IBAlO mgL+3活性炭的培养基中，幼茎和叶片从芽鞘中抽出，茎基部分化出根，形成完整的小植株。1987年，四川省林业科学研究所解继能、刘新蓉、周明晦等人报道了采用魔芋根状茎和球茎作外植体，
4、在MS+BAl0 mgL-1+2，4一D 05 mgL-1+ NAA 02 mgL-1及质量分数3蔗糖、08琼脂， pH58的培养条件下诱导愈伤组织，在12MS+ BA20IngL-1+IBA0125 mgL-1+NAA01 mgL-1，温度2505、光照12hd，光强15002000 lx的条件下分化出苗。 魔芋的组织培养技术虽然研究较早，但其成功应用是在21世纪，随着魔芋在食品、医药、化工等多个领域的广泛应用，魔芋的组织培养技术显示出无与伦比的优势。 2002年，云南省农业科学院生物技术研究所报道了一种魔芋组培苗批量化生产及组培苗栽培技术，由魔芋外植体冲洗、灭菌、接种、继代培养、生根培养及
5、幼苗出瓶、苗床中繁育块茎工序组成，其特征在于：采用接种和继代培养工序均用同一种培养基的一步成苗法，即先将块茎状的魔芋外植体冲洗，并按05cmO5cm为规格取顶芽部分，再分别用体积分数75酒精浸泡23 s和01升汞浸泡15 min，随即用无菌水冲洗，冲洗后的魔芋块茎外植体在培养基中，于温度20以上、光照1000 lx的环境中培养45 d后一次成苗，继代培养每隔2025 d继代一次，增殖倍数为1：4l：6，继代培养的温度20以上、光照1000 lx；生根培养是将在继代培养中长至34 cm高的丛生幼苗分单株切割开，放人培养基中1215 d，长出根后即出瓶，控制温度及光照与继代培养过程相同；出瓶的幼苗
6、先用质量分数01的多菌灵溶液清洗幼苗根部的培养基，随后将幼苗移至苗床中繁育块茎，块茎成熟时平均重量达50 g以上，并且大多数块茎又长出24个根状茎。 魔芋的品种不同，其愈伤组织和分化条件也有差异，西南农业大学园艺园林学院苏承刚、张兴国等报道了以南蛇棒魔芋和桂平魔芋的球茎、叶柄、鳞片、顶芽为外植体进行的组培及再生技术研究。南蛇棒魔芋球茎、叶柄、鳞片在MS附加15 nagL。6一BA和15 nlgLNAA的培养基中，愈伤组织诱导率达98；在 Ms附加15 mgL1 BA和01 mgL1 NAA分化培养基中，其分化率达95以上；纵切顶芽接人分化培养基中，可长出3个丛生芽，芽分化率达80以上；不定芽在
7、生根培养基MS附加O1 mgL-1BA和0510 mgL-1 NAA上，能100生根形成完整的植株。外植体消毒技术：在超净工作台上用体积分数75的乙醇浸泡30 s后，转入01氯化汞溶液中浸泡1012 rain L-1。桂平魔芋球茎、鳞片、顶芽等切块为外植体，愈伤组织诱导的适宜培养基为MS+6一 BA0510 mgL-1+NAA0510 mgL-1、球茎、鳞片诱导率达100，而顶芽切块诱导无效。愈伤组织芽分化最适培养基是MS+BAl5+NAAO01 mgL，分化率达90以上，顶芽切块在分化培养基上能长出丛生芽，频率达72。芽在MS+NAA0305 mgL-1培养基上都能100生根形成完整植株。外
8、植体消毒方式：用体积分数75乙醇浸泡30 s，再用01HgCI，浸泡灭菌8 min10 rain后用无菌水漂洗46次。 云南师范大学薯类作物研究所谢庆华、吴毅歆等报道了用白魔芋的5种营养器官作外植体在11种培养基上进行组织培养，M6培养基适于侧芽生长和皮下组织诱导愈伤，M9培养基适于主芽生长和基部组织诱导愈伤，M2培养基适于皮上芽苞组织分化生长，且皮上芽苞组织为最好的接种材料。魔芋皮上的芽苞多，用球茎上切取的皮上芽苞组织作为最佳接种的外植体。用体积分数75的酒精浸泡35 s，无菌水冲洗2次；01升汞水浸泡1012 rain，无菌水冲洗5次，为最佳的消毒方式。 20032004年，恩施州农科院魔
9、芋研究所在前人研究的基础上，采用正交试验优化了“清江花魔芋”的培养基配方和组织培养条件：以花魔芋小球茎或根状茎切块为外植体，在MS(或12MS)+6一BAI53OmgL-1+NAAO105 mgL-1+ IBA0510 mgL-1+糖30(pH62)的培养基上，暗培养15-20 d后，光照12 hd，不仅愈伤组织生长旺盛，而且可以一步成苗，形成完整的植株，能够按要求分批生产试管苗。 在魔芋组织培养技术的应用中，一个主要问题是消毒灭菌技术，由于魔芋球茎或根状茎生长在地下，温暖、潮湿的环境常常使其带有大量的细菌，且有些细菌已深入魔芋块茎内部，给魔芋的离体培养带来很大困难。以前的麾芋组培研究者采用常
10、规的酒精、HgCl，等溶液消毒灭菌，只能杀死表面的细菌，而无法渗入外植体内部，因此，尽管采取加大药剂浓度、延长消毒时间等多种措施，仍然难以达到理想的效果，常常在接种后造成大量的细菌和真菌污染，特别是在继代培养过程中，潜伏在外植体内的少量活的细菌继续繁殖，逐步表现出来，常造成大量污染，甚至造成毁灭性灾害，致使无菌繁殖体系难以建立，试管苗的工厂化生产难以进行。 恩施州农科院魔芋研究所陈永波等人在对“清江花魔芋”的试管苗批量化生产技术研究中，发展了一种新的消毒灭菌方法，使采用魔芋地下部分作外植体后期污染严重的问题得到了彻底解决，即采用甲醛一高锰酸钾熏气2030 min一酒精浸泡l minHgCl2浸
11、泡25 rain的综合消毒灭菌方法，既有效地杀死了外植体的内生菌，又杀死了表面细菌，使初次接种污染率控制在了10以下，继代培养污染率在5以下，能够建立良好的无菌繁殖体系，使魔芋试管苗和原原种的工厂化生产能够顺利进行。同时，熏气法还可应用于魔芋种芋的贮藏和播种前的消毒灭菌处理。 2试管芋生产技术 2003年，云南省农业科学院生物技术研究所报道了一种魔芋试管芋的繁育技术，由魔芋外植体冲洗、灭菌、接种、继代培养、生根培养、诱导小球茎及成熟小球茎出瓶植入苗床、繁殖块茎程序组成，其特征在于：魔芋组培苗生根培养时在生根培养基MS+ NAA051 mgL-1中加入质量分数1610-6的多效唑，在温度20以上
12、、光照1000 lx的环境中培养2025 d，组培苗生根的同时块茎膨大，形成小球茎；当小球茎长至24 g时，进行暗培养，培养温度在15以下，组培苗在瓶内lO15 d倒苗，形成成熟的小球茎；成熟的小球茎出瓶后经催芽处理植入苗床，在温度20C以上适当遮阴的条件下以30 d为一个周期施加营养，施加营养的质量比为N：P：K：Ca：Mg=5：1：5：05：1，该繁育技术当年就可收获100200 g的种芋和45个小子芋。 同时，西南农业大学也报道了一种魔芋试管芋快速繁殖方法，其目的在于提供一种既不在试管内成苗，也不像人工种子那样需要包裹上人工种衣，而是直接将试管不定芽培育成可以独立繁殖的微型芋。通过以下步
13、骤实现：取魔芋球茎、芽鳞片或叶柄组织，经表面消毒后切成051cm见方的小块，接种到附加053 mgL1 BA、012 mgL1 KT、01 mgLIAA、质量分数24蔗糖和07琼脂的MS培养基上，诱导愈伤组织的产生和不定芽的分化，切取不定芽，在上述培养基上离体无菌培育，使芽基部膨大充实成为小球茎。 恩施州农科院魔芋研究所在研究过程中发现在四季分明的南方地区，魔芋试管苗的最佳栽培时期在36月，7月以后栽培的试管苗长势弱，子芋少，因此在工厂化生产过程中，于23月将“清江花魔芋”的根状茎或小球茎在含质量分数O05的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+05维生素c的溶液中切块，接种于MS+6一BAl530 mg
14、L1+NAA0105 mgL1+IBA0510 mgL1+KT 15 mgL1+质量分数30糖(pH58)的培养基上，在26l进行14 d左右的暗培养，可有效防止切块的变褐，在培养基中加人质量分数005的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)能够防止继代培养过程中的褐变现象；在同一种培养基中，在6月以前生产试管苗，出瓶移栽，710月试管苗不宜出瓶移栽，但环境温度相对较高，试管苗直接在瓶内形成试管小球茎；10月至次年2月，愈伤组织接种于MS+6一BAl53O mgL1+NAA0105 mgL1+IBA051O mgL1+KTl5 mgL1+质量分数30糖(pH58)的培养基上，在25l，暗培养条件下形成大量不
15、定芽后，不定芽长至1cm时，关闭空调，在室温降至1518，不定芽基部膨大，形成多个小球茎，当年种植，可形成多叶和多个球茎。 3脱毒原原种生产技术 病毒对魔芋产量的影响虽然不及马铃薯，但由于魔芋长期无性繁殖，仍积累有多种病毒，试验表明，脱毒种芋仍可大幅度提高产量。脱毒原原种的生产，可以通过茎尖组织培养技术来实现。2004年，云南省农业科学院生物技术研究所王玲、李勇军、房亚南等报道了脱毒魔芋组织培养原原种生产技术：萌发1 cm左右花魔芋的顶芽，采用热处理茎 尖分生组织培养方法，经过丛芽诱导扩繁，培育出脱病脱毒魔芋良种的再生植株。当生根组培苗的根长至052 cm时，即可出瓶，洗净根部培养基，移栽至温
16、网室内。组培苗收获时可得到平均5060 g的种芋，最大的可达到200 g左右，芋鞭23个。脱病脱毒魔芋组培苗有3ll片叶，有的一棵魔芋可同时得到25个种芋。 组织培养的试管苗，必须经过严格检测后，才能确认为脱毒试管苗，魔芋的病毒检测方法尚无报道，可参考其它薯类如马铃薯、甘薯所用的方法，如“嫁接指示作物法”较为方便可靠，但魔芋以何种植物作为指示作物尚待研究。由于不知病毒的准确名称，云南省农科院王玲等采用电子显微镜直观检验病毒有无或多少，解决了病毒检验的难题，但电镜设备昂贵，一般检测室难以配置，其它的病毒检测方法还有待研究。 综上所述，通过近20年的研究，不同地区针对不同品种研究的魔芋试管苗、试管芋的生产技术已经成熟，目前已在云南、恩施等地成功应用于工厂化生产，至于脱毒原原种的生产技术，虽然采用热处理茎尖分生组织的方法可以达到脱毒的目的，但其检测手段和技术还不完善，还需进一步研究。 氨基酸和生物资源2005，27(4) 陈永波(恩施自治州农科院魔芋研究所，湖北恩施，445000)5