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1、白血病分子生物学,白血病分子生物学,白血病的分子机制 白血病的分子检测 白血病分子检测的临床应用,白血病的分子机制,基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。 癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。 癌基因活化的方式： 点突变 染色体重排 基因扩增 抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。,白血病的分子机制,白血病的分子机制,增殖过度 分化阻断 凋亡受抑,“二次打击”学说,D.Gary Gilliland Best Pr
2、actice 16:409-417,白血病的分子检测,Southern blot Northern blot Western blot FISH PCR 测序 芯片,白血病的分子检测,PCR反应原理,N = N0 x (1+E)n N：扩增子数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 n：循环数,白血病的分子检测,PCR理论方程,白血病的分子检测,PCR方法优点 快速 灵敏 特异 PCR方法缺点 假阳性 假阴性,白血病的分子检测,PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。 RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因。 巢式RT-PCR
3、：可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。 RQ-PCR：可定量扩增产物。,白血病的分子检测,RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化,TaqMan探针法,特异性高 多重基因定量 成本较高,SYBR Green I 法,成本低 最适合初步筛查 熔解曲线功能 无法多重检测 无模板特异性 灵敏度低,白血病的分子检测,CT值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数 CT值与起始模
4、板量成反比,白血病的分子检测,RQ-PCR的检测系统： 该系统内置了96孔PCR仪，且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实时检测的目的。 系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到CT值。 该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。,白血病的分子检测,RQ-PCR方法优点： 灵敏而特异 起点定量 闭管化学（污染的风险低） 没有PCR后处理（无需走胶，拍照等） 高度自动化 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 能做基因分型及SNP鉴定,
5、RQ-PCR的操作流程,从细胞或组织中抽提DNA或RNA,用PCR或RT-PCR扩增特异片段,将PCR产物克隆到合适的载体上,纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA,体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品）,构建标准曲线（CT lgcopy）,样品的定量检测,校正样品基因拷贝数,白血病分子检测的临床应用,白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义： 补充MIC检查的不足 发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（MRD） 为研究白血病的发病机制打下基础,白血病分子检测的临床应用,PCR方法检测MRD常用的分子标志,AML1-ETO,t(8;21)(q22;q22) 68%原
6、发性AML，在M2中的阳性率为2040%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他AML亚型（M3除外）好,AML1-ETO,对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况 RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水平。连续定量AML1-ETO转录本水平
7、可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发,AML1- 阴性 ETO+,C-KIT基因突变,C-KIT为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和c-KIT）成员之一 AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不导致白血病发生 C-KIT突变可见于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21)的M2患者 26/54例(48.1%) M2b患者中检测到C-KIT基因突变 57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未检测到C-KIT基因突变 以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关(R=0.94, P0.01),C-KIT基因突变,C-KIT基因结构,JM,C-
8、KIT基因突变,外周血白细胞计数,C-KIT基因突变,生存曲线,PML-RAR,t(15;17)(q22;q21) 98%M3患者 继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及RAR的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RAR，NPM-RAR，NuMA-RAR和STAT5b-RAR融合基因 临床上，具有PLZF-RAR或STAT5b-RAR融合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解,PML-RAR,AP
9、L累及的RAR基因及其伙伴基因结构示意图,PML-RAR,由于PML基因断裂点不同产生3种不同的PML-RAR异构体 约55%的M3患者为L型，40%为S型，5%为V型，且每位患者只表达一种PML-RAR融合蛋白 形态学上S型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度低,PML-RAR,RT-PCR检测PML-RAR是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监测。PML-RAR阳性提示的分子复发常早于临床复发3-6个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细
10、胞负荷，在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值,L+ 阴性 S+,FLT3基因突变,Fms-related tyrosine kinase 3 FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和c-KIT）成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用 综合国外各研究报道， FLT3-ITD和D835突变在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因 许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3突变患者预后较差，且可独立于核
11、型之外,FLT3基因突变,FLT3基因突变,FLT3基因主要突变类型,FLT3基因突变,mut-FLT3信号通路,FLT3基因突变,外周血白细胞计数,CBF-MYH11,inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22) 主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞M4，少见于M2 CBF-MYH11融合蛋白通过干扰核心结合因子（core binding factor,CBF）的转录激活作用而致病 具有CBF-MYH11的患者对化疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义,CBF-MYH11,CBF-MYH11具有多种变异型，其中最常见的为A型，占80% RT-PCR检测CBF-
12、MYH11进行MRD监测显示，大部分患者在完全缓解时PCR转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍为阳性 最新研究采用RQ-PCR检测CBF-MYH11转录本水平来评价M4Eo患者MRD情况，预示复发,NPM基因突变,Nucleophosmin，为核-浆穿梭蛋白，调控p53-ARF通路 见于50%核型正常的AML患者，而在伴低危/高危核型患者中极少见 主要见于M4/M5中 第12号外显子的插入/缺失 伴此突变患者WBC计数高 目前，此突变的预后价值各研究组报道不一，尚待进一步证实,DEK-CAN,t(6;9)(p23;q34) 主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB 伴DEK-CAN的患
13、者年龄一般较轻，且预后较差 此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案,N-RAS基因突变,为RAS基因家族成员之一，染色体定位于1p32.2。具有GTP/GDP结合和GTPase活性，调控正常细胞的生长 此基因突变存在于11-30%AML 突变热点位于codon12,13和61 在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，而在t(15;17)中低 伴此突变患者外周血WBC计数低 该突变预后意义尚不明,WT-1基因高表达,Wilms tumor 1 是无特异分子异常的急性白血病患者理想的MRD检测指标 伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关,BC
14、R-ABL,t(9;22)(q34;q11) 1530%成人ALL及35%儿童ALL 9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色体断裂点具有异质性 此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点 BCR-ABL+ALL患者预后差，5年存活率20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗,BCR-ABL,对于自体或异体移植ALL患者，移植前后BCR-ABL的有无以及BCR-ABL的转录本类型与预后有关,e1a2+ 阴性,E2A-PBX1,t(1;19)(q23;p13) 56%儿童ALL和3%成人ALL 此类患者
15、具有高的白细胞计数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后 核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要 E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实,TEL-AML1,t(12;21)(p13;q22) 25%儿童ALL，是儿童ALL中最常见的分子异常 目前为止尚未在T-ALL，AML或NHL中发现t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（2%） 此类患者发病年龄小（2岁10岁），WBC计数低（50 000/L），免疫表型为前B-ALL 此
16、类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好,TEL-AML1,由于12p和21q末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%，需应用FISH或RT-PCR方法提高检测阳性率 TEL基因重排是独立预后因素，RT-PCR检测TEL-AML1融合基因能将低危险度与高危险度的ALL患者区分开来。因此早期检测TEL-AML1融合基因对临床预后，确定合适的治疗方案都有重要意义,MLL相关融合基因,累及MLL基因的分子异常见于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受topoisomerase II抑制剂治疗的患者 MLL基因涉及五十余种染色体
17、易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有： t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4融合基因 ALL t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9融合基因 AML t(11;19)(p13;q23) MLL-ENL融合基因 AML及ALL,MLL相关融合基因,至今，MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能具有双重作用： 融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化 MLL发生断裂后，缺失锌指结构域的MLL不能与DNA结合，失去其转录活化功能，使受MLL调节的靶基因（HOX基因）表达异常，也影响造血细胞的发育,MLL-AF4,t(4;11)(q21
18、;q23) t(4;11)的发生率在不同年龄段是不同的，在婴儿ALL中最多见，为5070%，而在儿童和成人中较低，分别为2%和36% 此类患者发病年龄低（通常2岁），白细胞计数高，常伴有内脏巨大并累及中枢神经系统 此类患者病情凶险，预后差。患者对标准治疗方案很可能无效，需给予强化治疗。目前应用高剂量Ara-C治疗，使这些患者预后有所提高,MLL-AF4,对2岁的婴幼儿急性白血病患者应常规进行MLL-AF4融合基因的检测以筛选出高危患者，给予强化治疗提高生存率 RT-PCR可在所有t(4;11)患者初发时检测到MLL-AF4融合基因。由于该融合基因累及的2个基因的断裂点变异性较大，因此PCR应包
19、括所有断裂点以免产生假阴性结果,TAL1基因重排,t(1;14)(p32;q11)，TAL1-TCR融合基因 3%T-ALL 易位使TAL1基因与TCR位点并置，其5端正常转录调节被TCR 5部分所取代，而后者在T细胞中有高表达,TAL1基因重排,1p32缺失，SIL-TAL1融合基因 1626%T-ALL 该重组仅见于T-ALL，是T-ALL的一个有用的克隆标志 缺失部分可能为TAL1基因的调控序列，使TAL1基因表达失控，导致与染色体易位相似的表型 常规遗传学方法检测不到这一异常，而SIL-TAL1融合处特异的序列能作为这类患者特异的分子标志用于PCR检测,TAL1基因重排,TAL1异常仅
20、见于T-ALL，尚未见于B-ALL，AML和T细胞NHL，是儿童T-ALL中最常见非随机遗传缺陷，是监测大多数T-ALL的侯选基因 伴TAL1异常的患者血象表现为高白细胞计数，高血红蛋白含量，免疫表型为CD2+/CD10 尽管在治疗反应上，有TAL1重排患者和无TAL1重排患者无显著差异，但伴TAL1重排患者4年无事件生存率（EFS）高于不伴TAL1重排的患者，分别为5911%和447%，提示伴TAL1重排患者预后较好,HOX11基因异常表达,t(10;14)(q24;q11) ，t(7;10)(q34;q24) 7%的T-ALL 易位使HOX11基因受控于TCR和TCR基因调控序列，导致其异
21、常表达 另有部分HOX11高表达患者核型正常 伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，预后也较其他T-ALL患者要好，完全缓解率为100%，平均无病生存期为46个月，3年无病生存率为75%,HOX11L2基因异常表达,t(5;14)(q35;q32) 20%的儿童T-ALL 易位使HOX11L2基因处于CTIP2调控元件的控制下，而CTIP2基因在T淋巴细胞分化时高度表达 在随访患者中检测到高水平HOX11L2说明白血病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患者HOX11L2表达水平迅速降低，并维持在一个低水平。可见HOX11L2的表达水平可作为MRD检测的标志,NOTCH1基因突变,NOTCH1信
22、号对CLP(common lymphoid progenitors)向T细胞定向以及前T细胞受体复合物组装是必须的 35-50% T-ALL患者存在此基因突变 伴NOTCH1基因突变的成年T-ALL患者预后较差,NOTCH1基因突变,NOTCH1基因结构,NOTCH1基因突变,生存曲线,BCR-ABL,t(9;22)(q34;q11) 90% CML患者 BCR-ABL融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激酶活性较正常ABL高，可能是BCR对ABL激酶活性调节区的作用所致 由于5%CML患者为隐匿性Ph染色体，因此无Ph染色体CML患者还需使用更灵敏的分子检测手段如FISH或RT-PCR检测BCR
23、-ABL融合基因 RT-PCR还能区分e1-a2和b2-a2/b3-a2二种BCR-ABL转录本，从而区分ALL患者与CML急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案,BCR-ABL,巢式RT-PCR检测BCR-ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD监测。可在患者血液学复发前的624个月骨髓检测就呈阳性。 RQ-PCR还能动态观察患者治疗后BCR-ABL转录本水平变化情况，反映疗效。,b3a2+ b2a2+ 阴性,GATA2基因突变,调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力 CML急变患者中新发现GATA2基因突变， 而CML慢性期、加速期，A
24、ML（M1-M7），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常对照均未发现该突变，可见GATA2基因突变仅与CML急变相关，是CML疾病进展过程中的获得性突变。总发生率为12.5%（5/40），且均造成CML急粒单变 GATA2基因突变与CML患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明,JAK2基因突变,Janus kinase 2 此基因突变主要见于MPD和MDS，另可存在于部分AML尤M2 突变为V617F 突变去除了JAK2 JH2负性调控，导致该基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优势 JAK2可成为靶向治疗的靶点,MDS相关基因异常,Delta样(Dlk)基因编码Dlk蛋白在MDS
25、明显增高者55%，而AML仅10%，可能是MDS特异性基因，但作为诊断MDS的标志基因尚待进一步确定,MDS相关基因异常,RAS 此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶(GTPase)调节细胞生长相关信号 ras癌基因的活化，尤其是N-ras的激活可在约35%的MDS患者中发生 FMS 为集落刺激因子1，控制单核-巨噬细胞生长、分化及功能 fms基因的突变可在16%的MDS患者中发现 ras和fms突变主要见于粒-单细胞分化的疾病，即MDS中的CMML，患者生存期短，转AML多,MDS相关基因异常,p53 在MDS时，p53突变较少见(5%)，但在较为进展的病例中可高达15% p53突变意味着化
26、疗耐药和生存期缩短，因而是一种有意义的预后指标 FLT3 10%MDS有FLT3点突变，加快进展为AML，但FLT3-ITD少见 AML1(RUNX1) 为MDS较常见的点突变，发生率25%，导致核心结合因子(CBF)亚单位正常功能缺失，易转化AML,Ig/TCR基因重排,Ig/TCR基因重排检测，对决定白血病的细胞来源系列乃至分化阶段，有重大意义 在B系ALL中分别有95%，54%，55%和33%的患者有IgH，TCR，TCR和TCR基因重排，在T-ALL中相应的基因重排率分别为14%，68%，91%和89% 由于重排的多样性，重排的Ig和TCR基因连结区序列在各淋巴(前体)细胞中是不同的，
27、因而每位患者有其各自特异的Ig/TCR基因重排序列，这一特定的Ig/TCR基因重排序列可作为该恶性克隆的分子标志，在分子水平进行诊断分型，还可通过PCR检测缓解期患者有无初发时的Ig/TCR基因重排来追踪残余白血病细胞，用于预后判断,Ig/TCR基因重排,Ig的基因由L，L和H三个基因组组成，分别编码L链，L链和H链。L和H基因又由编码Ig分子的V区和C区基因构成。 B细胞分化： IgH重排 重排 IgH/表达 IgH重排 重排 IgH/表达 错误重排/缺失,Ig/TCR基因重排,TCR由两条肽链组成，链或链，不论是哪一种肽链，其胞膜外区均包括两部分，即V区和C区。相应的编码基因为TCRA,TCRB, TCRG和TCRD。 T细胞分化： TCRD重排 TCRG重排 TCR表达 TCRB重排 TCRA重排 TCR表达 TCRD缺失,Ig/TCR基因重排,Ig/TCR基因多样性的机制 组合造成的多样性 2x106 Ig, 3x106 TCR, 5x103TCR 连接造成的多样性 1012 Ig和TCR 体细胞高频突变造成的多样性 仅限于成熟B淋巴细胞,Ig/TCR基因重排,V-D-J重排：IgH,TCRB,TCRD V-J重排：L,L,TCRA,TCRG,Ig/TCR基因重排,谢 谢！,