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1、微生物学之微生物的生长,第四章微生物的生长,第一节微生物的分离和纯培养第二节微生物的生长繁殖第三节微生物生长的环境因素,微生物的分离和纯培养一、无菌技术二、获得纯培养的方法用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单细胞(单孢子)分离选择培养分离二元培养物三、微生物的保藏技术,第四章微生物的生长,无菌技术在微生物研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂天然微生物群中分离出特定微生物，且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染的技术被称为无菌技术，它是保

2、证微生物学研究正常进行的关键。,第四章微生物的生长,微生物培养常用器具及灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质称为培养基(culture medium)可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。,第四章微生物的生长,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可杀灭所有生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。,第四章微生物的生长,为防止杂菌，特别是空气中杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都

3、需采用适宜塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中其他微生物不能通过。平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物污染而设计。,第四章微生物的生长,接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。因打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行：在火焰附近进行熟练无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。,第四章微生物的生长,第四章微生物

4、的生长,纯培养：微生物学把从一个细胞或同一个细胞群繁殖得到的子代，称纯培养或纯种。纯培养的类型：菌种纯（菌落纯）：是分离菌落而得到的；菌株纯（细胞纯）：是分离单个细胞得到的。,稀释倒平板法涂布平板法平板划线分离法稀释摇管法,第四章微生物的生长,用固体培养基分离纯培养,用固体培养基分离纯培养不同微生物在特定培养基上形成的菌落或菌苔一般都具稳定特征，可成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立菌落，采用适宜的平板分离法很易得到纯培养。,第四章微生物的生长,所谓（培养）平板，是指熔化的

5、固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。,第四章微生物的生长,固体培养基，可使每个孤立活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。,第四章微生物的生长,稀释倒平板法待分离材料用无菌水作一系列稀释，取不同稀释液少许，与熔化且冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌平板，保温培养一定

6、时间，可能出现在平板表面的单个菌落，该菌落可能是由一个菌体繁殖形成。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。,第四章微生物的生长,涂布平板法在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。,第四章微生物的生长,Pour plate,Pour plate,Pour plate,平板划线分离法用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线

7、或其他形式连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,第四章微生物的生长,稀释摇管法对厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法。将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后，冷却并保持在50左右，梯度稀释待分离材料，试管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱中间，挑取和移植单菌落。,第四章微生物的生长,第四章微生物的生长,液体培养基分离纯培养,1)接种物在液体培养基中进行顺序稀释。 2)

8、高度稀释,一支试管分配不到一个微生物。 3)必须在同一个稀释度的许多平等试管中，大多数（95%以上）表现为不生长。 4)有微生物生长的试管得到的培养物就认为是纯培养。,适宜于不能在固体培养基上生长的微生物如一些细胞大的细菌、原生动物和藻类。,第四章微生物的生长,较大的微生物，可用毛细管提取单个个体，并在大量灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪。市售显微操作仪种类多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得

9、纯培养。对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。,单细胞(单孢子)分离,选择培养分离选择培养基直接分离富集培养,第四章微生物的生长,选择培养分离没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长要求，在一定程度上所有培养基都是选择性的。迄今，能培养的微生物1%，不可培养99%。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其他被抑制。,第四章微生物的生长,第四章微生物的生长,如果某微生物生长需要是已知的，也可设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，

10、即使在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。,第四章微生物的生长,无氮培养基筛出固氮菌；加刚果红或结晶紫的YMA筛出根瘤菌；无有机碳源的培养基筛出硝化细菌；无有机碳源的培养基且无氧有光环境筛出光合细菌；高浓度NaCl的培养基筛出耐盐菌株; 伊红美蓝的培养基筛出大肠杆菌；青霉素的培养基筛出酵母菌、霉菌; 加某抗生素的平板筛出相应抗生素抗性菌株; 阳性克隆子的筛选；溶磷菌解钾菌拮抗菌 ,富集培养：主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环

11、境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更易从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可据分离的微生物特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。,第四章微生物的生长,用途：富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物

12、能在这种特定的环境中生长。,第四章微生物的生长,例：采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程：（1）首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基，并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。,第四章微生物的生长,（2）取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中大大提高，将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。,第四章

13、微生物的生长,（3）挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为不生长，说明通过该富集程序得到了欲分离的目标微生物。,第四章微生物的生长,（4）通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。,第四章微生物的生长,二元培养物只有一种微生物的培养物称纯培养物，含二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，且是有意识地保持二者间特定关系的培养物称二元培养物。二

14、元培养物是保存病毒的最有效途径。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到最接近于纯培养的培养方法。,第四章微生物的生长,微生物的保藏技术传代培养保藏冷冻保藏干燥保藏法,第四章微生物的生长,菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。保藏技术的要求(不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状) 菌种或培养物保藏的重要性,菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，美国典型菌种保藏中心(ATCC)，世界菌种保藏联合会(WFG

15、C) 。,第四章微生物的生长,传代培养保藏常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种。传代培养十分繁琐，容易污染，特别是由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化。,第四章微生物的生长,冷冻保藏使微生物处于冷冻状态，代谢作用停止以达到保藏目的。微生物细胞对低温敏感，可用速冻、快速升温和添加各种保护剂等手段。液氮保藏或-70低温保藏。用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。,第四章微生物的生长,干燥

16、保藏法水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。,第四章微生物的生长,沙土管保存主要适用于产孢子微生物，如芽孢杆菌、放线菌等。将菌种接种培养，长出大量的孢子，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，抽干水分，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。,第四章微生物的生长,冷冻真空干燥保藏将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，经真空冰升

17、华作用除水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体密闭环境中置低温保存，使微生物处于干燥、缺氧及低温、休眠状态，可达到长期保藏目的。冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，为大多数专业的菌种保藏机构均采用。,第四章微生物的生长,微生物的生长繁殖一、细菌的群体生长繁殖（一）分批培养中细菌的群体生长繁殖（二）连续培养二、微生物群体生长的测定计数法重量法生理指标法,第四章微生物的生长,微生物生长繁殖微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定

18、方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,第四章微生物的生长,生长与繁殖是两个相互联系的概念。生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新生命个体的质变过程。高等生物这两个过程可明显分开，但低等特别单细胞生物，因个体微小，这两个过程很难划分。因此在讨论微生物生长时，往往将这两个过程放在一起讨论，这是微生物群体生长：在一定时间和条件下细胞数量的增加。,第四章微生物的生长,Prokaryotic Cell(Bacillus megaterium),除某些真菌外，我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个，而是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接

19、种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。,第四章微生物的生长,分批培养：是采用完全封闭容器，一次接种，一次性加入培养基进行的培养，是实验室培养微生物最常用的方法。生长曲线：细菌接种到液体培养基后，以裂殖繁殖，子细胞都具生活能力。不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变，以时间为横轴，以菌数为纵轴，据不同培养时间细菌数量的变化，作一条反映细菌在整个培养期菌数的变化规律曲线。,第四章微生物的生长,一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。迟缓期(lag phase) 细菌接种到新鲜培养基而处于新生长环境，因此在

20、一段时间里并不马上分裂，细菌数量维持恒定，或增加很少。此时胞内的RNA、蛋白质等物质含量有所增加，相对地此时的细胞体积最大，说明细菌并不是处于完全静止的状态等。,第四章微生物的生长,产生迟缓期的原因，微生物接种到一新环境，暂时缺乏足够能量和必需的生长因子，“种子”老化(即处于非对数生长期)或未充分活化，接种时造成损伤等。,第四章微生物的生长,在工业发酵和科研中迟缓期会增加生产周期而产生不利的影响，但是迟缓期必需，因细胞分裂前，细胞各成分复制与装配等需时间，因此应采取一定措施缩短迟缓期：通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；利用对数生长期的细胞作为“种子”；

21、尽量使接种前后使用的培养基组成不相差太大；适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良影响。,第四章微生物的生长,对数生长期(log Phase)：又称指数生长期。细菌经迟缓期进入对数生长期，并以最大速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，且细菌内各成分按比例有规律增加，此期内细菌生长是平衡生长。对数生长期细菌代谢活性、酶活性高而稳定，大小比较一致，生活力强，因而它广泛地在生产上用作“种子”和在科研上作为理想的实验材料。生产上如以获菌体为目的，该期最好,第四章微生物的生长,对数生长期的生长速率可用代时表示。代时，即单个细胞完成一次分裂所需的时间，亦即增加一代所需的

22、时间(也叫增代时间或世代时间)。在此阶段，由于代时稳定，因此，只要知道了对数期中任何两个时间的菌数，就可求出细菌的代时。,第四章微生物的生长,稳定生长期(stationary phase)：因营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量)，进入稳定生长期。活细菌数最高并维持稳定。如及时采取措施，补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等可延长稳定生长期，获得更多菌体物质或代谢产物。（生产上如以获代谢产物为目的，该期最好）,第四章微生物的生长,衰亡期：

23、营养物耗尽和有毒代谢物大量积累，细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少，标志进入衰亡期。该时期细菌代谢活性降低，衰老并出现自溶，且死亡细菌量以对数方式增加，但衰亡期后期，因部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。,第四章微生物的生长,此外，不同的微生物，甚至同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(如葡萄糖等)；有的需经过一定适应期后才能获得利用能力(如乳糖等)。前者通常称为速效碳源(或氮源)，后者称为迟效碳源(或氮源)。当培养基中同时含有这两类碳源(或氮源)时，微生物在生长过程中会产生二次生长现象。,第四章微生物的生长,第四章微

24、生物的生长,一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。,.,连续培养：在微生物整个培养间，以一定方式使微生物能以恒定比生长速率生长并能持续生长的一种培养方法。根据生长曲线，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要原因。因此在微生物培养过程中不断补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养基本原则。,第四章微生物的生长,第四章微生物的生长,连续培养的优缺点最大优点：微生物能在比较恒定的生长条件下以恒定的生长速度生长；缩短生长周期，提高生产设备的利用率，降低产品成本。缺点：营养物质的利用率低；

25、感染杂菌的机会增多；菌体易老化，衰退。,微生物生长情况可通过测定单位时间里微生物数量或生物量的变化来评价。通过微生物生长的测定可客观评价培养条件、营养物质等对生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果，或客观地反映微生物生长的规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。,第四章微生物的生长,微生物生长的测定计数法此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又常分为直接计数和间接计数两类。除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法。,第四章微生物

26、的生长,直接计数这类方法是利用特定的细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数4000l000稀释倍数,第四章微生物的生长,间接计数此法又称活菌计数法，其原理是在高稀释度下，微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，每一个活的单细胞均能繁殖形成一个菌落，因而可用平皿培养的方法使每个活细胞生长并形成一个单独的菌落，通过统计长出的菌落数来推算待测样品中的活菌数。,第四章微生物的生长,具体做法：将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，再采作用混菌法或涂布法

27、来进行测数。但在实际操作中难以做到使所有细胞完全分开，即不能保证每个菌落都是由个细胞分裂而来，所以现在多用菌落形成单位（CFU：colony forming units）来表示。,第四章微生物的生长,应用: 此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。但因该法能测出样品中微量菌数，仍是教学、科研和生产上常用的测定细菌数的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物，如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等营养体等。,第四章微生物的生长,膜过滤法（测活菌数）是当

28、样品中菌数很低时，可以将一定体积的潮水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色(活菌指示剂)，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数.,第四章微生物的生长,比浊法（测总菌数）原理是在一定范围内，菌悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可借助分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density，即O.D.)表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发展迅速，现有多种多样快速、简易、自动化仪器和装置等方法。,第四章微生

29、物的生长,重量法此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。微生物湿重微生物干重蛋白质总量 DNA含量,第四章微生物的生长,测定菌体湿重或干重法原理是据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝间的自由水，再称重求湿重。细菌样品和丝状菌样品，均可将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。,第四

30、章微生物的生长,如要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。,第四章微生物的生长,蛋白质总量蛋白质是细胞的主要成分，含量也较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测总氮量。蛋白质含氮量为16%，细菌中蛋白质含量占细菌干物重50%80%，一般以65%为代表，有些细菌则只占13%14%，这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。,第四章微生物的生长,因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：

31、蛋白质总量含氮量6.25 细胞总量蛋白质总量(50%80%(或65%)蛋白质总量1.5,第四章微生物的生长,DNA含量核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.410-5ng。因此从一定体积的细菌悬液中所含细菌中提取DNA，求DNA含量，再计算这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。,第四章微生物的生长,生理指标法生理指标包括微生物呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。据微生物生长过程中伴随出现的这些指标，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。,第四

32、章微生物的生长,微生物生长的环境因素一、温度 1、微生物生长的温度范围 2、微生物的温度类型 3、温度在微生物工作中的应用高温灭菌：干热灭菌；湿热灭菌（煮沸消毒法，高压蒸汽灭菌，间歇灭菌，巴斯德消毒法）。低温保藏菌种和食品二、水分和空气湿度,第四章微生物的生长,三、氢离子浓度（pH）： 1、不同微生物的生长pH范围 2、微生物培养过程中pH调节措施。四、氧气及氧化还原电位：五、辐射、紫外线辐射（UV）的应用六、化学药物：有机化合物、无机化合物、染色剂,第四章微生物的生长,1、微生物生长的温度范围不同微生物对温度的要求不同

33、，各种微生物都有其生长繁殖的最低、最高、最适生长温度(又称三基点温度)。在微生物生长的温度范围内，随着温度的升高，微生物的活力及酶活力增强。注意：最适的生长繁殖温度不一定是微生物代谢的最适温度。eg.青霉素产生菌-产黄青霉虽在30时生长最快，而青霉素产生的最适温度则在20-25。,第四章微生物的生长,微生物生长的温度类型,注：中温型有的还分为室温型、体温型两类。冷藏食品的变质往往是低温型微生物作用的结果。,温度在微生物工作中的应用 1、利用高温致死温度灭菌（见培养基的灭菌）致死温度：通常把能在10min.内杀死某种微生物的高温界限。大多数细菌、病毒、酵母菌和丝状真菌营养体

34、的致死温度是50-65，放线菌和真菌孢子的抗热能力稍强，致死温度为75-80；细菌的芽孢抗热能力极强，能耐100以上的高温。 2、低温保藏菌种,第四章微生物的生长,二、水分及可给性 1、水的可给性：微生物对水分的需求可用水活度来表示（常以水活度值(water activity, w)表示），它是一种反映环境中水对微生物生长可给性高低的指标。水活度值是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比。微生物一般在w为0.60-0.99的条件下生长，w过低时，微生物生长的迟缓期延长，比生长速率和总生长量减少。,第四章微生物的生长,微生物不同

35、，其生长的最适w不同。一般而言，细菌生长最适w较酵母菌和霉菌高，而嗜盐微生物生长最适w则较低。,第四章微生物的生长,2、渗透压在微生物正常生长下，细胞内溶质的浓度高于细胞外溶质浓度，所以水分能通过半透性的质膜进入细胞内，由于细胞壁的保护作用避免了因水分的无限流入造成的质膜破裂。而高渗环境会使细胞脱水、造成生理干燥，原生质收缩引起质壁分离现象，因而能抑制大多数微生物生长。(低渗溶液能破坏去壁的细胞原生质体。),第四章微生物的生长,高渗环境防止食品腐败：盐渍：利用高浓度(常用10-15%)食盐人工造成高渗环境来保存食品，如腊肉；糖渍：人工利用高浓度蔗糖(常用

36、50-70%)造成高渗环境来保存食品。eg.罐头。(该浓度具有杀菌效果),第四章微生物的生长,三、氢离子浓度（pH） (1) 不同微生物生长pH范围自然界中pH1-11都有微生物的生活，但只的少数种类能在pH2以下和pH10以上生长。大多数种类生活在pH4-9的环境中。每种微生物都有生长的最低、最适、最高pH。,第四章微生物的生长,对微生物的作用机制：影响细胞质膜电荷和养料的吸收；影响酶的活性；改变环境中养料的可给性或有害物质的毒性。,第四章微生物的生长,一些微生物生长pH范围,(2) 微生物培养过程中PH调节措施,第四章微生物

37、的生长,四、氧气及氧化还原电位：按照微生物与氧的关系，可将微生物分成(220)：需氧性微生物、厌氧性微生物（又称嫌气性微生物）、兼性厌氧微生物。,第四章微生物的生长,不同微生物的Eh,举例：（兼性厌氧微生物）酒精发酵：先通气，获得大量菌体，再不通气生产代谢产物-酒精。,1、可见光光合微生物，如蓝细菌、藻类等；非光合微生物：有的表现一定的趋光性。一些真菌在形成子实体和孢子时，也需要一些散射光的刺激。如：蘑菇和灵芝菌必须在散射光的照射下形成子实体。,第四章微生物的生长,2、电离辐射：X射线、射线、射线和射线均为电离辐射。其共同点是波长短、能量大、能使被

38、照射物中水分子发生电离产生游离基，能与细胞中的敏感蛋白分子作用使其失活，从而使细胞受到损伤或死亡。对不耐热的物(食)品杀菌。,第四章微生物的生长,紫外线（实验室用得最多）：低剂量的紫外线，会刺激微生物的生长；高剂量的紫外线，240-300nm的紫外线对微生物具有致死效应。其最强作用的波长是265-266nm，这是核酸的最大吸收波长。其杀菌机理主要在于可引起DNA分子中相邻的胸腺嘧啶（T）产生二聚体，进而引起微生物的突变或死亡。,第四章微生物的生长,但紫外线的穿透力弱，实际工作中常用作空气或器皿表面灭菌和微生物的诱变育种。为避免光复活现象，紫外线照射灭菌后的分离培

39、养工作须在红光或避光条件下进行。,第四章微生物的生长,光复活：在光照下光解酶转变紫外线诱导的胸腺嘧啶二聚体返回单聚体。在依赖于光的修复机制中，光解酶与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)能切割相邻嘧啶间的环丁烷环恢复为原来的单聚体。,第四章微生物的生长,化学杀菌剂和抑制剂 (一)、有机化合物 1、酚类：主要是损伤微生物细胞壁和细胞质膜，使酶钝化和蛋白质变性。是医学上普遍使用的一种消毒剂。如：苯酚(假借名义俗称石碳酸)等。,第四章微生物的生长,2、醇类： 70-75%乙醇，纯的或高浓度的乙醇因能使菌体表面蛋白质凝固，不易渗透进入细胞，所以杀菌效果极小。对

40、细菌芽孢和无包膜病毒的杀菌效果较差，所以长期使用的酒精溶液(包括70-75%的消毒酒精)中可能含有细菌芽孢，需经细菌过滤器或蒸馏除去。,第四章微生物的生长,3、醛类：能与蛋白质中氨基酸的多种基团(-NH2、-OH、-COOH和-SH等)共价结合而使基变性，达到杀菌的目的。其中福尔马林(37%-40%的甲醛水溶液)和戊二醛有较强的杀菌作用。,第四章微生物的生长,4、酸类：有机酸能抑制微生物(尤其是霉菌)的酶和代谢活性，常加在食品和饮料中以抑制霉菌等微生物的生长。山梨酸和苯甲酸常用作食品和饮料的防腐剂。,第四章微生物的生长,5、表面活性剂：具有杀菌作

41、用，是由于他能吸附在微生物细胞的表面，改变了细胞的稳定性和透性，使细胞内的物质逸出膜外，引起微生物停滞或死亡。常用的具有表面活性剂性质的是新洁尔灭、杜灭芬等。,第四章微生物的生长,(二)、无机化合物 1、卤化物：杀菌效力：FClBrI。其中碘和氯最常用。碘的杀菌机制可能是通过与细胞中酶和蛋白质中的酪氨酸结合而发挥作用，以细菌、真菌、病毒和芽孢均有较好的杀菌效果。,第四章微生物的生长,2、重金属及化合物：均具有很强的杀菌力，其中尢以Hg+、Ag+、和Cu2+最强。0.2%的HgCl2溶液是实验室常用表面菌剂。稀性重金属进入细胞后主要与酶可蛋白质上的-SH基结合而使

42、之失活或变性达到杀菌目的。,第四章微生物的生长,3、氧化剂：通过对细胞成分的氧化作用产生杀菌效果。最常用的是高锰酸钾和过氧化氢。臭氧是很强的氧化剂，但目前存在的问题是成本太高和有效期太短。,第四章微生物的生长,(三)、染色剂带有阳离子电荷的碱基染色剂如结晶紫、亚甲基蓝、孔雀绿等都有抑制细菌生长的作用。其阳离子基团能与细胞蛋白质氨基酸上的羧基结合或核酸上的磷酸基结合，因而阻断了正常的细胞代谢过程。G+细菌一般对碱性染料敏感。结晶紫常用于抑制G+芽孢杆菌的生长。,一第四章微生物的生长,第四章微生物的生长,1、名词解释：纯培养、分批培养、连续培养、水活度、灭菌和消毒、生长曲线、代时 2、了解获得纯培养的方法：稀释平皿分离法（混菌法、涂布法）、平皿划线分离、选择培养分离 3、细菌分批培养的典型生长曲线及划分时期，每个时期的特点？ 4、一般而言，细菌、放线菌，酵母和霉菌生长在什么pH环境？ 5、了解微生物群体生长的测定：间接计数法、直接计数法。,

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