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1、细菌的特殊染色技术,一、目的要求,学习并掌握芽胞染色法原理和方法，并了解芽胞的形态特征； 学习并掌握荚膜染色法原理和方法，并了解荚膜的形态特征； 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。,二、基本原理,用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。,荚膜是包裹在某些细菌细胞外的一层黏液状或胶状物质，含水量很高，其他成分主要为多糖、多肽或糖蛋白等。荚膜不易着色且容易被水洗去，因此常用负染法进行
2、染色，而荚膜不着色，在深色背景下呈现发亮区域。 由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。,二、基本原理,三、器材,菌种 枯草芽胞杆菌、褐球固氮菌 2d营养琼脂斜面培养物。 溶液和试剂 5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、绘图墨水（滤纸过滤后使用）等。 仪器和其他用品 酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管、烧杯、试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。,四、操作步骤,1、芽胞染色 制片 按常规方法涂片、干燥及固定；（回忆涂片的关键环节？） 加热染色 向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹
3、住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸；（保持涂菌部位的染液不干涸，否则菌体变性，无法观察） 脱色 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止； 复染 用0.5%番红水溶液复染2min； 水洗 用缓流自来水冲洗至流出水无色为止； 镜检,成功的关键： （1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽胞，而老龄菌芽胞囊已破裂； （2）加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽胞囊破裂，加热不够则芽胞难以着色； （3）脱色必须等待玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。,2、荚膜染色 1、取干净载玻片，在其上滴加 1d 绘图墨水，挑取少量菌体于其中混匀； 2、盖上盖玻片，镜检即可。（尽量不要混入空气） 成功的关键： （1）载玻片必须干净无油迹，否则混合液不能均匀铺开； （2）绘图墨水使用量要很少，否则会完全覆盖菌体与荚膜，难以观察； （3）制片过程中所涉及的固定及干燥步骤均不能加热和用热风吹干，因为荚膜含水量高，加热会使其失水变形。同时，加热会使菌体失水收缩，与细胞周围染料（或绘图墨水）脱离而产生透明的明亮区，导致某些不产荚膜的细菌被误认为有荚膜。,四、操作步骤,芽孢形状,荚膜,