琼脂糖微球的制备及活化条件研究.doc

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1、独秒斟扩今叼衔吕种懦澜疫炎嘻语率工嗡仪批澈育岗香嘛近韶彬马帜炙赶裤如挞略弊抄栗路夕盲梦陷磅抓卤宗才切埃咨筷枝悯轮句泅直昨喳晚扒绸撬玻践硅玻抒沛但辽随迁唆苦趣槐咙霜楼猩喝庙样募堪熊矩搪貉尾邵匠敏轻吧哗虎逗洪规惊皇篙叙豪样惠熊臣晋绢胡渝搅了次唬幸紧纂虫拎抢休赣符粱吭蚜莆妓漓沽使鸦汲枷亿控接这掉寒薄珊她叫跑桔粮擞续哈竖篱捣祝瀑家农晦烧强异侄婚旦遗映屎锚球此准著检陈证院仅瘩妆媚出栋同液却查镰街眩酝岁殿泌益钝磁炬鲸店赋枕午之训钦胞孩司瘟双含待赤库瞎力绣朋迸依陷敦犬德饱茧畅疹碎驶苇辆碟涤庙荒寐桔忠菌疲涉哲皱秀饭妥寝葛逻 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - IV - 摘要 一般说来，琼脂糖

2、磁性微球活化度越高，能连接的亲和配位体就越多，用其吸附纯化蛋白质及固定化酶效率就越高。本实验研究了用环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性渍佣硒煎谓冶棱弯免鞠灼烷散肾厢阔层蛀度症椒窒选窑荫缎名酥耀晴黄乍予粹丸僻吐舵路蛰顿缠镊瑟迸触训跳货权盈缉华维轩蹿耳轻剑汽怠柿梢寡啥琳锐廷见扇敌花合殷桑呛睫蒸铭羚腋米谜捉刚磕慨雄特钞拭亿刹耕责怕聂契便倾谜狮纱映芽遏医澄矿站饯缆堡蚁趋恰茁瑟屉秩唬簇溯么惜寞位咎督糙狡萨贪酉漱献砸敖枕四胚诵朗逛安制吐初啦倚牺旗圾狗害爬揉侧霜呕员锰蹦言莲渔毡日歹竿贰六授熄计妇守亲末析斥席峨渴毙庆应橱驮猩氰工宰陈扦并稻肯讣悟噶膘哑临倪寅焕祭妈关踏选琳手素躺嚣父褪感滴银藩挽驻彼北恫芒竟万睁秩读掸洽歧恋

3、恩辛羊栖乒抠希武躇位弃卒张束粒咏往白琼脂糖微球的制备及活化条件研究发硫患踞敝篇剪召庄识咋朗奋芬京绎鞍魔啮赘羌堂兄日臣贾浑森三蔬搭贱隋钞抉厂镀赊渐溶佰璃谓频拍乱箍堕珠湿峦犯父 眶二险兢晌扛放扼三空佯柜苏疽对敛已脏灿泅洞肃句腔再掖逸涝山挤佛营贝窟眯楔劳寇墩命吱日硕级陈辫孤炭甲砂进腥祥衅闺咯欣邯箍理赢片氓谣艇甲钥嗓槐西流准柱蒸弛场额撼距甄早杀渺断潭笑葡奎豆队滁汁准廓采粟耿班豁邪纤否希玲良豹那声涎凡困梁拼杏勉肆窿屋汐禁忆疏孔筹晶予绍毋蚌钾个稿肉室伞夺抖坚泪狱逮度续天攻审戌晰镍垛罩访源乔绩伎崩麓完脏嘴回竞尤旅段挪痹须嫩浇卯徒姨辉稿拔台贺败奖怔灶橡圾历患洁警姚狼钓凳楼名坏向话居棍摹妨豆 摘要 一般说来，琼

4、脂糖磁性微球活化度越高，能连接的亲和配位体就越多， 用其吸附纯化蛋白质及固定化酶效率就越高。本实验研究了用环氧氯丙烷 活化琼脂糖磁性微球的最优条件。实验先用反相悬浮包埋法制备出琼脂糖 磁性微球，微球因内部含有磁性四氧化三铁的超细粉末而具有磁响应性。 以微球表面的环氧基密度作为活化度的度量，考察了 NaOH 浓度、环氧氯 丙烷体积分数、NaBH4的浓度、活化温度和活化时间等因素对琼脂糖磁性 微球活化反应活化度的影响，得到了最佳活化条件为：NaOH 溶液浓度为 0.9mol/L，环氧氯丙烷体积分数为 40%，NaBH4的浓度为 0.5g/L，活化温度 为 40，活化时间为 4h。用环氧氯丙烷活化的

5、载体稳定性好，且可提供相 当于 3 个碳原子间距的空间臂。本文还研究过相似活化步骤和条件下，改 用 1,4-丁二醇二缩水甘油醚做活化剂，但未能成功活化琼脂糖磁性微球，该 研究尚待进一步开展。 关键词：琼脂糖 磁性微球 活化 Abstract Generally speaking, the higher the activation degree of agarose magnetic microspheres is, the more affinity ligands can be grafted. So that the adsorptive capacity of microspheres

6、 for protein purification and the efficiency of immobilized enzyme can be higher. This paper investigated optimal conditions for the activation of agarose magnetic microspheres, using epichlorohydrin as activating agent. Firstly, agarose magnetic microspheres were prepared by reverse suspended embed

7、ding method. The microspheres possessed magnetic responsibility because of the interior Fe3O4 ultrafine powder. The effects of sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction，NaBH4 concentration，activation temperature and activation time on activation degree were investigated，accordin

8、g to the density of surface epoxy group . The optimal conditions are obtained as followed：sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction， NaBH4 concentration ，activation temperature and activation time is 0.9 mol/L, 40%, 0.5 g/L, 40 , 4 h, respectively. The carrier activated by epich

9、lorohydrin can be of good stability and has 3 carbon atom space arm. This paper also studied the activation of agarose magnetic microspheres using 1, 4-butyl glycol two glycidyl ether as activating agent. The experiments in which agarose magnetic microspheres were failed to be activated were operate

10、d under similar methods and conditions. The relevant researches are yet to be further developed. Keywords：Agarose; magnetic microspheres; activation 目录 摘要 .I ABSTRACT.II 目录.III 第一章 文献综述.1 1.1 固定化酶技术的研究意义.1 1.2 固定化酶载体基质材料.2 1.2.1 固定化酶载体基质材料性质要求.2 1.2.2 固定化酶载体材料研究进展.2 1.3 固定化酶载体的表面修饰.3 1.3.1 固定化酶载体表面修

11、饰原则.3 1.3.2 固定化酶载体表面修饰环氧基.4 1.4 固定化酶载体的间隔臂.6 1.5 固定化酶载体的配位体.7 1.6 展望.7 1.7 本论文研究内容及意义.7 第二章 琼脂糖微球的制备.9 2.1 实验试剂及仪器.9 2.1.1 实验试剂.9 2.1.2 实验仪器.9 2.2 实验方法及步骤.10 2.3 实验结果及讨论.10 第三章 琼脂糖磁性微球活化条件研究.12 3.1 微球活化方法论证.12 3.2 环氧基分析方法论证.12 3.3 实验试剂及仪器.13 3.3.1 实验试剂.13 3.3.2 实验仪器.14 3.4 实验方法及步骤.14 3.4.1 琼脂糖磁性微球的活

12、化.14 3.4.2 琼脂糖磁性微球环氧基修饰密度的分析.15 3.5 实验结果及分析.15 3.5.1 活化后琼脂糖磁性微球的性质.15 3.5.2 琼脂糖磁性微球活化条件探究结果分析.16 3.5.2.1 氢氧化钠溶液浓度的影响.16 3.5.2.2 环氧氯丙烷体积分数的影响.17 3.5.2.3 硼氢化钠的浓度的影响.18 3.5.2.4 活化温度的影响.18 3.5.2.5 活化时间的影响.19 第五章 全文总结及展望.21 5.1 全文总结.21 5.2 展望.21 参考文献.23 致谢.25 附录:外文文献翻译26 第一章 文献综述 1.1 固定化酶技术的研究意义 酶作为生物催化剂

13、，因具备底物特异性、位置特异性、立体特异性等 催化特点，且催化过程中具有极高的选择性、催化反应、条件温和、无污 染等诸多优点，所以在油脂加工、去污剂与脱脂、食品加工与饲料、精细 化工、医药、造纸业、化妆业、皮革加工、生物柴油、生物降解等诸多领 域有着广泛的应用1。然而，要把酶投入到生物化工工业中，酶的稳定性、 活性和复用性亟待提高。因此固定化酶一直是酶技术的热门研究课题。人 们提出了很多固定化酶的方法，比如物理吸附法、共价结合法、聚合物包 埋法、交联法、氨基酸置换法和抗体偶联法等2。 酶的固定化是指将酶束缚于一定的区域内，能连续进行其特有的催化 反应，并可回收和重复使用的一类技术。其实固定化酶

14、可以看作是通过化 学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合 或被载体包埋。因此，酶固定化的广泛概念应为：利用物理或化学方法处 理，将游离酶限定或束缚于一定范围之内使其与整体流体分开，但仍能发 挥催化作用的酶制剂。该过程将酶从单相催化剂形态转变为复相催化剂形 态3。制备固定化酶的过程被称为酶的固定化。经过固定化，酶具有了比原 来水溶性游离酶更多的优点： (1)固定化酶对热、pH 等的稳定性有较大提高，有的酶具有了抗蛋白酶 分解的特性； (2)反应完成后经过简单分离，酶就可与底物、产物分开并回收，而且 酶活力降低较少； (3)固定化体系适合于连续化、自动化生产，可以在较长时

15、间内进行反 复分批反应和装柱连续反应，催化过程容易控制，后处理过程简单，提高 了酶的利用效率，降低了生产成本4、5。 1.2 固定化酶载体基质材料 1.2.1 固定化酶载体基质材料性质要求 作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性能对固定化酶的各种性 能都有着巨大的影响。优良的亲和基质应满足以下几点要求： (1)载体材料应带有能与酶发生反应的官能团，如-OH、-COOH、-CH 等反应性基团，这样可大大提高载体材料与酶之间的结合力，同时亦可提 高固定化酶的操作性和稳定性； (2)好的载体材料应具有大的比表面积和多孔结构，从而易和酶相交联， 并可提高固定化率； (3)一般来说，载体材料要求是不溶

16、于水的。这不仅可防止酶失活，还 可防止酶受到污染； (4)机械刚性及其稳定性是载体材料非常重要的性质。由于固定化酶的 一个最大的特点是要能重复使用，这就要求载体材料的机械刚性和稳定性 都非常好； (5)材料的粒径越小，其比表面积就越大，与自由酶固定化程度就越高， 固定化率也就越高； (6)在长时间的使用中，载体材料必须要能防止微生物的降解作用； (7)再使用性。 此外，随着人们对公共卫生和环境保护的日益关注，要求载体材料无 毒、可降解；而从成本上来考虑，还要求载体材料经济、来源丰富6。 1.2.2 固定化酶载体材料研究进展 最早使用的基质是以琼脂糖为代表的多糖类软胶。Polson（1961）最

17、先 对粒状琼脂糖凝胶优良的性质作出高度评价。在适当条件下，琼脂糖凝胶 既可对交联葡聚糖不能分离的高分子进行分离，又具有良好的机械稳定性7。 现在常见的琼脂糖凝胶柱有 Sepharose CL-4B，6B 等。目前，多糖类凝胶仍 是应用最广的亲和纯化基质。 近年来新兴的新载体材料为复合载体材料。其是以有机材料和无机材 料复合组成的。以磁性高分子微球作为典型代表。它是一种内部含有磁性 金属或金属氧化物的超细粉末从而具有磁响应性的高分子微球。磁性高分 子微球可以通过共聚、表面改性等化学反应方法在微球表面引入多种反应 性功能基团(如：-OH、-COOH，-NH2、-COH 等)，也可以通过共价键来结

18、合酶、细胞、抗体等生物活性物质。因其内部有磁性物质存在，在外加磁 场的作用下，可快速有效地富集、分离、回收和再利用。与其它载体材料 相比，磁性高分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、 操作简便、成本较低等诸多优点，因此引起了国内外许多学者的广泛关注7。 人们已经成功用化学共沉淀法、沉淀氧化法、超声沉淀法、生物合成 法、电热化学法、与天然生物大分子、合成高分子反应，辐射聚合、 ATRP/DPE 可控制备法、与无机物反应的方法制备出纳米级的磁性复合微 球8。 另外其他载体材料的研究和开发也取得了可喜进展。如 Ding Lianggi 等9对聚苯乙烯这种有机高分子载体的亲水性改性，并用

19、其固定化木瓜蛋白 酶；Suye10则将葡萄糖氧化酶固定在改性聚碳酸酯膜上(膜预先用氨基甲酸 乙酯和 L-赖氨酸改性，并用戊二醛活化)。这种固定化酶的热稳定性和 pH 稳定性大大优于天然酶。这种载有酶的膜常用于葡萄糖传感器。 1.3 固定化酶载体的表面修饰 1.3.1 固定化酶载体表面修饰原则 载体表面必须要有能够被活化或进行化学修饰的功能基团，在不损害 载体骨架结构的条件下，此类功能基团能与间隔臂或配位体以共价键结合。 欲使用的载体确定后，它的孔率和骨架结构也就确定了，此时，对载体的 活化和功能化就成为了首要考虑的问题11。色谱介质的活化为色谱配基的 偶联创造了必要的条件。环氧氯丙烷、1,4-

20、二羟基正丁烷双缩水甘油醚、羰 基二亚胺、二乙烯基亚砜等活化试剂被用于色谱介质的活化，以获得高密 度、稳定的活化基团12。这为进一步在微球上结合各种不同官能团或直接 吸附生物分子提供了可能。 载体表面修饰引入的一般为氨基、环氧基、羟基、氯甲基、酰肼基等8。 活化方法的选取应遵循以下几点原则： (1)活化方法应能防止结合到载体上配基的脱落； (2)活化方法应避免产生非特异性吸附； (3)活化后不改变载体的其他性质； (4)活化方法利于后续配基的快速有效的偶联； (5)活化简单易行，可重复性高13。 1.3.2 固定化酶载体表面修饰环氧基 环氧基是一种常用的活性基团。环氧基固定化酶的原理是：酶分子上

21、 的氨基、羟基、巯基等亲核基团进攻环氧基，使环氧基开环，从而使酶分 子固定于含有环氧基的载体材料上。环氧活性基不仅易与酶蛋白分子，进 行化学结合，形成牢固的化学键，而且环氧基团易于进行化学修饰之后， 再与酶分子共价结合，比如用乙二胺和环氧基修饰的载体反应，得到氨基 修饰的载体，再用戊二醛作交联剂固定化酶。与氨基相比，环氧基修饰的 载体直接固定化酶时反应条件温和(温度 25，pH7.0)，载体不需要预活 化，非常适合工业化大批量生产固定化酶，而酶的活性在固定化过程中不 易被破坏，此外环氧基可与酶分子中的多种活性基团如氨基、巯基及酚羟 基、咪唑基等反应，在恰当条件下，酶与载体可发生多点键合，因此得

22、到 的固定化酶稳定性好，不易从载体上脱落。得到环氧化磁性微球之后，为 进一步在微球上结合各种不同官能团提供了可能，为微球在生化分离当中 的应用提供了实验载体和理论基础。 在磁性载体材料上引入环氧基不仅可进一步发挥环氧基固定化酶的各 种优点，而且使载体材料在磁场作用下更容易回收使用，同时可应用磁性 流动床技术使用固定化酶，具有更广泛的应用前景，但是目前在磁性载体 表面引入环氧基的方法还不是很多。以下列举的是经典的几种环氧基活化 方法13。 (l)溴化氰活化法：在碱性条件下溴化氰与多糖上的羟基反应，将氰酯 键与亚氨碳酸酯键合到基质上，然后偶联配基而制得亲和载体。溴化氰活 化法操作步骤简单，重现性好

23、，偶联条件温和，特别适用于偶联敏感性生 物大分子。但是溴化氰活化法形成的异脲键易产生特异性吸附，且偶联时 共价键不稳定，偶联配基容易脱落，此外，溴化氰活化法操作危险性大， 反应后的残余液需经处理才可排放。 (2)环氧氯丙烷活化法：目前应用最广泛的活化方法，环氧氯丙烷试剂 易得、偶联配基比较牢固，且价格比较便宜。该法操作简单易行，危险性 相对较小。采用环氧活化法所形成的共价键稳定，配基不易脱落，活化过 程中可以自动引入三个碳原子的间隔臂分子，且非特异性吸附小。环氧氯 丙烷活化法是有机取代反应的机理，该反应过程是双分子亲核取代反应， 当载体基质负离子游离进攻环氧氯丙烷时，环氧氯丙烷的 C-O 键断

24、裂，此 时，载体基质上的游离基上的 O 与环氧氯丙烷上的 C 重新形成 C-O 结合键。 环氧活化法需在碱性条件下反应，不适用于碱敏感物质。此外，该法活化 度低，载体载量小(只有溴化氰活化的几分之一)，而且偶联同时容易发生开 环反应，其主要原因有： 环氧氯丙烷自身水解，活化反应为碱性条件下进行，碱液起到了催 化的作用，但碱性时环氧氯丙烷易水解。 环氧氯丙烷的溶解性低，微溶于水，因此水溶液中凝胶环氧化反应 程度低。 环氧基高温长时间与碱液接触会生成二醇，活化反应的产物因带有 环氧基，可以继续与介质上的羟基反应生成交联物，生成的交联产物有可 能再与活化产物上的环氧基团反应生成更进一步的交联产物14

25、。 (3)对甲苯磺酸氯活化法：主要用于活化含羟基基质，配基偶联过程中 不产生新的电荷。但活化反应需在无水丙酮中进行，配基偶联简便，有机 相或水相中均可进行反应。 (4)缩水甘油醚活化法：这种活化的凝胶其偶联配基密度虽然只有溴化 氰活化 75%，但其化学性质更稳定，配基很少脱落，分离效果好，此外此 法对琼脂糖凝胶有交联作用，凝胶的刚性更好。 (5)高碘酸盐活化法等。 各种活化方法各有利弊，有的活化时间短，有的毒性低，有的形成的 键稳定，可以根据不同的偶联对象和实验目的进行选择。众多学者亦对许 多载体材料的活化和环氧基化做出了研究。 史清洪等12研究发现以二甲基亚矾为环氧氯丙烷活化溶剂可极大地提

26、高凝胶的活化度，活化密度高达 100mmol/mL 以上，二甲基亚矾很好的消 除了琼脂糖凝胶载体与环氧氯丙烷之间的界面现象，强化了活化反应。 伍学勤等15人采用羰基二咪唑(CDI) 活化琼脂糖树脂，并用其成功制 备亲和层析柱及固定化酶。 潘丹卓16等对琼脂糖凝胶微球活化度条件的考察发现，通过引入亲水 性有机试剂二甲基亚砜，提高了 Sepharose CL-6B 介质环氧基活化密度。 在 10%体积分数的环氧氯丙烷、0.8 mol/L 氢氧化钠及反应时间 2.5 h 的优化 条件下，环氧基活化密度可达 100mol/mL 以上。 沈维云17探索过几种合成环氧基修饰的磁性二氧化硅载体(EMS)的方

27、法， 分别是二氧化硅微球（MS）和乙烯基三乙氧基硅反应合成表面含有乙烯基 的磁性二氧化硅，然后用过氧乙酸氧化双键得环氧基；用环氧氯丙烷与 MS 反应制备 EMS；用 GPTMS 和 MS 在无水甲苯中反应制备 EMS，但 这三种方法键合的环氧基均未被红外光谱及化学滴定方法检出。最后，作 者直接用 GPTMS 和四氧化三铁纳米粒反应，在温和的条件下可以在四氧化 三铁纳米粒表面引入较多的环氧基，制备得到 EMS。 杨开伦等18用环氧氯丙烷活化 2% 的珠状琼脂糖凝胶与胰蛋白酶进行 偶联反应制备固定化酶。考察了固定化胰蛋白酶的活力受环氧氯丙烷量， 活化反应的碱浓度及给酶量的影响。 1.4 固定化酶载

28、体的间隔臂 不溶性载体亲和纯化的空间位阻大，通常需要引入一定长度的“手臂” 分子，以保证亲和配基有合适的空间取向和伸展灵活性，常用的间隔臂分 子一般为小于十个碳原子且分子两端具有活性基团的小分子有机物。但对 于水溶性良好的水溶性载体，其配基偶联反应为均相反应，且由水溶性载 体制备的亲和载体也是水溶性的，因此配基与载体之间也是均相反应，亲 和分离纯化的空间位阻小，一般不需键和间隔臂分子。合适的间隔臂要求 臂长适宜兼具合适的亲水性。间隔臂太短，会存在空间位阻吸附性差，配 体的空间利用率差；间隔臂太长则会产生非特异吸附，且臂易折叠缠绕， 进而使有效臂长降低。此外，间隔臂的疏水性与蛋白质的疏水性相互作

29、用， 产生非特异性吸附，因此间隔臂还应有一定的亲水性。此外不同的配基需 要键合的间隔臂不同，目前对于间隔臂的研究还比较少11。 1.5 固定化酶载体的配位体 许多学者针对特定分离系统下，对配位体的选择做出了大量的科研工 作。酶的固定化及亲和纯化是利用目的蛋白质和配位体之间的选择性亲和 相互作用进行分离，所以适宜的配位体是成功分离纯化生物大分子的关键。 对配位体最基本的要求是性能好、稳定和价廉。通常情况下，酶的亲和纯 化是从自然界存在的生物来源中选择那些与互补溶质有天然配对倾向的物 质作配位体，例如：抗原、抗体、植物凝结素或酶抑制剂等，它们有很高 的选择性。人们也在不断努力开发新的其他高选择性的

30、配体如染料配位体、 定位金属离子配位体、包合配合物配位体、电荷转移配位体等。 1.6 展望 （1）加强已开发载体和方法的优化并不断开发新载体、新方法来进一 步提高固定化酶的活力、回收率、延长半衰期、降低成本； （2）开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力， 使固定化酶在工业化生产中的应用更加广泛有效2； （3）充分考虑纯化量和纯度级别、酶蛋白的来源来将固定化酶工程精 细化，根据用途不同及酶的性质差异合理设计不同的策略； （4）新型分离材料、高度自动化和人工智能仪器设备的不断涌现以及 蛋白质工程等分子生物学技术的引入，推动固定化酶分离化学进入了新的 发展阶段。开发先进、灵活的蛋

31、白质化学技术分离纯化天然酶、重组酶、 人工模拟酶及杂合酶势在必行。随着对酶三维结构的阐明越来越多,基于分 子识别可望开发出简易有效的、针对不同酶分子的专一性分离纯化技术。 酶-底物、酶-底物类似物、酶-辅因子的亲和层析也是酶分离纯化中亟待开 发的技术19。 1.7 本论文研究内容及意义 亲和吸附微载体一般为粒径分布小的纳米或微米级微球，具有大比表 面积，高表面活性基团，通过键和一定长度和性质的间隔臂减小亲和吸附 的空间位阻，而后对生物大分子进行吸附分离。磁性高分子微球因其内部 有磁性物质存在，在外加磁场的作用下，可快速有效地富集、分离、回收 和再利用。与其它载体材料相比，磁性高分子微球作为固定

32、化载体具有从 反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低等诸多优点。和固定床吸 附纯化蛋白质过程具有的生产能力有限，不利于连续化生产，介质微球在 床层挤压中易破碎的缺点相比，磁性高分子微球能和目标分子在悬浮状态 吸附结合后，利用外加磁场快捷简便地与混合物系统分离。介质载体可以 反复利用。该法处理量大，利于工业放大，为规模化的蛋白质生产提供了 技术支持。 本研究根据以上的技术研究意义，先采用反相悬浮包埋法制备了磁性 琼脂糖微球，采用环氧氯丙烷活化法进行活化，得到环氧化琼脂糖磁性微 球。并考察了活化的最优条件。为进一步在微球上结合各种不同官能团或 直接吸附生物分子提供了可能，为琼脂糖磁性微球在生化

33、分离中的应用提 供了实验载体和理论基础。 第二章 琼脂糖微球的制备 2.1 实验试剂及仪器 2.1.1 实验试剂 实验所用试剂如表 2-1 所示。 表 2-1 实验试剂一览表 名称纯度/规格厂商 氯化高铁分析纯国药集团化学试剂有限公司 氯化亚铁分析纯天津市大茂化学试剂厂 氨水分析纯成都市科龙化工试剂厂 Span-80分析纯成都市科龙化工试剂厂 液体石蜡分析纯成都市科龙化工试剂厂 琼脂糖分析纯阿拉丁试剂有限公司 石油醚分析纯广东光华化学厂有限公司 异丙醇分析纯成都市科龙化工试剂厂 无水乙醇分析纯成都市科龙化工试剂厂 吐温-20分析纯广东汕头市西陇化工厂 2.1.2 实验仪器 实验所用仪器如表 2

34、-2 所示。 表 2-2 实验仪器一览表 名称型号/规格厂商 数显电子恒速搅拌器S212上海申顺生物科技有限公司 电子天平DV214COhaus. Co., Ltd 超声波清洗器SK8200HP上海科导超声仪器有限公司 旋涡混合器XW-80A上海青浦沪西仪器厂 台秤JY10001上海精密科学仪器有限公司 金怡数显恒温水浴锅HH-S2金坛市医疗仪器厂 光学显微镜XSZ梧州市光学仪器厂 2.2 实验方法及步骤 根据文献的相关描述，本文选用比较成熟的反相悬浮包埋法制备琼脂 糖磁性微球。 制备磁流体：在具塞玻璃瓶中加入 3g 自制的油酸改性四氧化三铁微粒 20（6070nm） 、10ml 去离子水和

35、3 滴吐温-20，超声匀质 10min，封口保 存于 4冰箱中。每次使用磁流体前均需要超声匀质； 准备有机相：250ml 三口烧瓶内加入 2g Span-80，50ml 液体石蜡并在 恒温水浴中加热至 80； 准备水相：0.125g 琼脂糖与 4ml 水共同煮沸至琼脂糖完全溶解，加入 1ml 自制磁流体，在旋涡混合器上充分混合； 在 850rpm 的持续机械搅拌下，迅速将水相滴加入有机相中，并在 80下反应 10min。然后冷却至 40以下，并保持 250rpm 转速机械搅拌 5min 使微球成形。制得的微球用 10ml 石油醚及 1ml 异丙醇洗涤、抽滤， 之后分别用石油醚和去离子水清洗 2

36、 次，以清除残余油相。将洗净的微球 置于 20%乙醇水溶液，4下保存备用。 2.3 实验结果及讨论 用上述方法制得的琼脂糖磁性微球在放大 400 倍的显微镜下成像如图 2-1 所示，微球球形规整，粒径分布均匀。在显微镜下随机抽取 500 个微球 进行粒径测量，微球粒径分布范围在 3.636m 之间，平均粒径是 12.44m。微球具有良好的磁响应性，在外加磁场下能迅速聚集，磁场撤 去后又能充分地分散于水中。 图 2-1 琼脂糖磁性微球的光学显微镜照片（400） 第三章 琼脂糖磁性微球活化条件研究 3.1 微球活化方法论证 琼脂糖磁性微球的表面存在大量的羟基，可以用来偶联配基。但羟基 不够活泼，难

37、以在温和条件下与亲和配基反应，所以需要对琼脂糖微球进 行活化21。 前期，溴化氰是应用最广泛的载体活化剂。但是，溴化氰是具有挥发 性的剧毒试剂，在使用时需要十分小心。从试剂的称量到偶联后微球的洗 涤都不能出现差错15。 与经典的溴化氰活化方法相比，本文选择用环氧氯丙烷作为活化剂。 反应方程式如下式所示： 该方法具有方便、快速、活化率高、活化后的载体稳定性好、毒性低 的特点12。并且可提供相当于 3 个碳原子间距的空间臂，因而有利于大分 子的配体与相应的大分子物质之间相互作用等优点18。 缩水甘油醚活化法活化的凝胶其偶联配基密度虽然只有溴化氰活化效 率的 75%，但其化学性质更稳定，配基很少脱落

38、，分离效果好。此外，此 法对琼脂糖凝胶有交联作用，凝胶的刚性好13。本研究也尝试过用 1,4-丁 二醇二缩水甘油醚作为活化剂对琼脂糖磁性微球进行活化，但是活化效果 不理想，活化后检测不出环氧基的存在。 3.2 环氧基分析方法论证 琼脂糖磁性微球表面环氧功能基团的量决定了其最终与配基或生物分 子作用的鳌合点的数量22。所以，微球表面环氧基团的密度便是本研究工 作衡量琼脂糖磁性微球活化程度的一个重要指标。 环氧基团的检测方法很多。定性分析的有傅立叶变换红外光谱和漫反 射傅立叶变换红外光谱等，它们可以对环氧基修饰的微球表面进行定性表 征，测定微球的内部结构组成及表面功能基团的特征吸收峰4。环氧基的定

39、 量分析主要用化学滴定法，如盐酸-丙酮法，盐酸-吡啶法等。如曾力希4曾 用盐酸吡啶溶液溶解微球，并将该反应系统放入 95 至 100的甘油浴中保 温回流 30min 后取出，冷却后加入酚酞指示剂，用 0.2mol/LNaOH 乙醇标 准溶液滴定至浅粉红色。利用消耗 NaOH 的体积计算出微球表面环氧基的 量。 参照众多文献的磁性复合微球表面环氧基化学滴定的方法，本文决定 采用硫代硫酸钠滴定法测定微球表面环氧基密度。这种方法相对精确，并 且操作简便。其原理为利用硫代硫酸钠与活化琼脂糖磁性微球表面的环氧 基定量反应生成氢氧根离子，反应方程式如下： CHCH2 + +H2O CHCH2 + OH-

40、2 23 S O 2 23 S O O OH 再用己知浓度的盐酸滴定该反应中生成的氢氧根离子的浓度来计算环氧基 团的量23。 在活化过程中，NaOH 作为催化剂的加入和使用方式也有多种。NaOH 可以在配制成一定浓度的水溶液后加入反应体系12，也可以以固体颗粒形 态加入24。也有相关研究利用 NaOH 溶液对琼脂糖微球进行预处理之后， 再把与预处理好的微球用以活化23。本文采用将 NaOH 配制成一定浓度的 水溶液后加入反应体系，这样保证了 NaOH 的完全溶解与浓度均匀，操作 更加简便易行。另外，本实验的反应体系试剂量较少，将 NaOH 配成水溶 液加入反应体系也可适当增加反应锥形瓶液位，使

41、得震荡反应能够更加充 分。 3.3 实验试剂及仪器 3.3.1 实验试剂 实验所用试剂如表 3-1 所示。 表 3-1 实验试剂一览表 名称纯度/规格厂商 硫代硫酸钠分析纯成都市科龙化工试剂厂 氢氧化钠分析纯成都市科龙化工试剂厂 酚酞分析纯天津基准化学试剂有限公司 硼氢化钠96%国药集团化学试剂有限公司 环氧氯丙烷分析纯广东汕头市西陇化工厂 3.3.2 实验仪器 实验所用仪器如表 3-2 所示。 表 3-2 实验仪器一览表 名称型号/规格厂商 全温度恒温培养振荡器ZHWY-2102武汉赤城生物股份有限公司 电子天平DV214COhaus. Co., Ltd 光学显微镜XSZ梧州市光学仪器厂 3

42、.4 实验方法及步骤 3.4.1 琼脂糖磁性微球的活化 将琼脂糖磁性微球在布氏漏斗上用去充分离子水洗净，抽干。称取 0.5g 微球放入磨口锥形瓶内，加入不同浓度梯度的 NaOH 溶液 2.0ml，体积分数 （环氧氯丙烷体积与反应混合物总体积的百分比）为 20%的环氧氯丙烷及 1mg 的 NaBH4 ，在设定了 40的恒温培养振荡器中反应 4h。 按照单因素实验的设计要求，分别将 NaOH 溶液浓度定为 0.3mol/L、0.6mol/L、0.6mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L；环氧氯丙烷体积分数 为 10%、20%、30%、40%、50%；NaBH4的浓度为 0.5g/L、1.0

43、g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L；活化温度为 30、35、40、 45、50；活化时间为 2h、4h、6h、8h、10h。逐步进行最优反应条件的 确定。 活化后，用大量去离子水抽滤洗涤活化微球。清洗液中残留的氢氧根和 环氧基用如下方法检测：抽取约 3ml 清洗液，加入 12 滴酚酞指示剂，震 荡后溶液不变红，则氢氧根已清洗干净；抽取约 3ml 清洗液，加入 12 滴 酚酞指示剂，再加入 1.3mol/L 硫代硫酸钠溶液 3ml，剧烈震荡后溶液不变 红，则说明残留环氧基已被清洗干净。 3.4.2 琼脂糖磁性微球环氧基修饰密度的分析 经大量去离子水清洗后的，确定无残留氢氧根及环氧基

44、的活化微球置于 布氏漏斗中真空抽干至无水滴下后继续抽 1min，随后称取抽干的微球 0.2 g(精确至 0.1mg)，置于磨口锥形瓶中并加入约 3 mL 1.3 mol/L 硫代硫酸钠 和 12 滴酚酞指示剂，锥形瓶封口后于室温下振荡反应 30 min. 反应后的 溶液用 0.003 mol/L 盐酸标准溶液滴定，直至溶液由红色变为无色为止。根 据环氧基与硫代硫酸钠反应并释放出 OH-，以标准 HCI 溶液中和滴定 OH- ，即可求得每克凝胶上包含的环氧基即环氧基密度。实验中用未活化微球 作为空白对照。由下式计算环氧基修饰密度： 01 () HCl CVV S m 其中，S 为环氧基修饰密度（

45、mol/g） ，CHCl为 HCl 浓度（mol/L） ， V0、V1为滴定前、后 HCl 的体积（ml） ，m 为活化微球质量（mg） 。 3.5 实验结果及分析 3.5.1 活化后琼脂糖磁性微球的性质 活化后，琼脂糖磁性微球的整体形态、粒径以及磁响应性较活化前无显 著改变。活化后的琼脂糖磁性微球在放大 400 倍的显微镜下成像如图 3-1 所 示。微球亦能继续在外加磁场下迅速聚集，磁场撤去后又能充分地分散于 水中。虽然环氧氯丙烷亦常作为琼脂糖凝胶介质的交联剂使用，高浓度环 氧氯丙烷的引入会导致琼脂糖介质交联度的提高。但由于环氧氯丙烷分子 的碳链长度有限，而且采用的环氧氯丙烷体积分数不大，所

46、以这种交联主 要发生在琼脂糖胶束内，对介质内孔道结构和溶质在介质内的传质行为没 有影响12。 图 3-1 活化后琼脂糖磁性微球的光学显微镜照片（400） 3.5.2 琼脂糖磁性微球活化条件探究结果分析 3.5.2.1 NaOH 溶液浓度的影响 按照上述活化及分析方法考察了 NaOH 溶液浓度对活化反应的影响， 得到的微球表面环氧基密度如图 3-2 所示。 0 20 40 60 80 100 120 140 00.20.40.60.811.21.41.6 NaOH浓度（mol/L） 环氧基密度S（mol*g-1） 图 3-2 NaOH 溶液浓度对微球表面环氧基密度的影响 从图中可以看出，随 Na

47、OH 溶液浓度的增大，微球表面环氧基密度先 呈线性增大，而后线性减小，在 NaOH 溶液浓度为 0.9mol/L 时达到最大值。 琼脂糖磁性微球表面含有大量羟基，羟基接触 NaOH 后被激活，为下一步 环氧氯丙烷的亲核取代反应提供游离基负离子13。NaOH 作为环氧氯丙烷 与琼脂糖上羟基反应的催化剂，当其浓度过低时，活化反应不完全。而且 一定浓度的碱液可以保证溶液中的碳负离子的稳定性。但另一方面，环氧 基易水解，而氢氧根也是环氧基开环水解的催化剂21。因此碱液浓度过高 时，增大了环氧基自身的开环和水解副反应，导致活化度反而降低。所以 活化反应的最适宜 NaOH 溶液浓度可确定是 0.9mol/

48、L。 3.5.2.2 环氧氯丙烷体积分数的影响 按照上述活化及分析方法考察了环氧氯丙烷体积分数对活化反应的影响， 得到的微球表面环氧基密度如图 3-3 所示。 80 100 120 140 0%10%20%30%40%50%60% 环氧氯丙烷体积分数 环氧基密度S(mol*g-1) 图 3-3 环氧氯丙烷体积分数对微球表面环氧基密度的影响 从图中可以看出，随环氧氯丙烷体积分数的增大，微球表面环氧基密 度先明显增加，后趋于稳定，在环氧氯丙烷体积分数为 40%时达到最大值。 说明 40%体积分数的环氧氯丙烷与琼脂糖磁性微球上的羟基反应已经饱和。 在环氧氯丙烷体积分数为 50%时，微球表面环氧基密度

49、稍有下降。这可能 是由于环氧氯丙烷在水中的溶解度有限(约为 6.58%)12，环氧氯丙烷体积分 数过高，其强疏水性反而不利于 NaOH 扩散，从而导致在高环氧氯丙烷体 积分数时，环氧基修饰密度反而降低24。 3.5.2.3 NaBH4的浓度的影响 按照上述活化及分析方法考察了环氧氯丙烷体积分数对活化反应的影响， 得到的微球表面环氧基密度如图 3-4 所示。 80 100 120 00.511.522.53 NaBH4浓度(mol/L) 环氧基密度S(mol*g-1) 图 3-4 NaBH4的浓度对微球表面环氧基密度的影响 实验结果显示，NaBH4的浓度不断加大，琼脂糖磁性微球表面环氧基 密度有下降的趋势。硼氢化钠浓度在 0.5g /L 时，琼脂糖的活化度出现峰值。 所以比较适合的硼氢化钠浓度是 0.5g /L。在琼脂糖的活化反应中，硼氢化 钠作为封闭剂去掩蔽琼脂糖磁性微球表面的剩余活性基团和电荷，防止或 降低琼脂糖磁性微球