18β甘草次酸衍生物对smmc-7721的影响 毕业论文.doc

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1、18 甘草次酸衍生物对 smmc-7721 的影响 Effects of 18-glycyrrhetinic Acid Derivatives in SMMC-7721 cells 摘要：目的：研究 18-甘草次酸衍生物对 SMMC-7721、细胞增殖的影响。 方法：利用细胞计数法，倒置显微镜法，MTT 法，oecHhst-33258 染色法，流式 细胞仪检测法，观察和研究经不同浓度 18-甘草次酸衍物作用 24h，48h 和 72h 的肝癌细胞 SMMC-7721 的形态结构，生长抑制率,细胞凋亡的变化，并探究 了对 SMMC-7721 影响的最适 18-甘草次酸衍物的浓度。结论：经不同浓度

2、的 18-甘草次酸衍物作用后的 SMMC-7721，经显微镜观察显示:细胞的形态发生 改变，出现膨胀或皱缩现象；通过 MTT 检测表明细胞的增殖抑制率随 18-甘 草次酸衍物浓度的增加而增加，随着作用时间的增长而增加，通过，Hoechst- 33258 试剂盒染色法研究表明 18-甘草次酸衍物还可影响细胞的凋亡。 关键词：18-甘草次酸衍物SMMC-7721 细胞增殖 细胞凋亡 细胞形态 Effects of 18-glycyrrhetinic Acid Derivatives in SMMC-7721 cells Abstract: Purpose: Study the 18-glycyrr

3、hetinic Acid Derivatives to cancer of the liver the influence of cells. Methods: Using the method of microscopic to inverted microscope, MTT method, Hoechst-33258 Staining Kit. In order to observations and research the 18-glycyrrhetinic Acid Derivatives training 24 h, 48 h and 72h of liver cancer ce

4、lls SMMC-7721 the morphological structure, growth inhibition rate and the change of the cell apoptosis. And we will explore the effect of SMMC-7721 on the most suitable 18-glycyrrhetinic acid derivative of concentration. Conclusion: the18-glycyrrhetinic acid derivative cultured SMMC- 7721, the micro

5、scope observation showed that: cell morphological changes, swelling or shrinkage phenomenon; detected by MTT showed that the inhibition rate of cell proliferation with the increase of 18 - glycyrrhetinic acid derivative concentration increases with time, with the growth of increase, through, Hoechst

6、-33258 kit staining showed that 18-glycyrrhetinic acid derivative can also influencecellapoptosis Keywords:18 - glycyrrhetinic acid derivative SMMC-7721 cells proliferation and apoptosi 目录 前 言 .2 1.实验用品 5 1.1 仪器 .5 1.2 试剂 .5 2.试验方法 5 2.11640 培养基的配置 .5 2.1.1 过滤器的准备和安装 .5 2.1.21640 培养基的配置 .5 2.2 细胞复苏

7、.6 2.3 细胞传代 .6 2.4 细胞冻存 .7 2.5 利用 MTT 法检测 18-甘草次酸衍生物对肝癌细胞的抑制率 7 2.5.1 试剂配制 .8 2.5.2 细胞计数 .8 2.5.3 利用 MTT 法检测 18-甘草次酸衍生物对肝癌细胞的抑制率 8 2.6 用 18-甘草次酸衍生物作用肝癌细胞后进行显微镜观察 .9 2.7 利用 Hoechst-33258 细胞凋亡染色试剂盒检测细胞凋亡情况 .9 3.结果与分析 .10 3.218-甘草次酸衍生物对肝癌细胞形态结构的影响 .13 3.318-甘草次酸的衍生物对肝癌细胞凋亡的影响 .13 4.结论 .14 参考文献 .14 前 言

8、豆科植物甘草( Glycyrrhiza uralensis Fisch) 光果甘草、胀果甘草干燥 根和根茎。性平,味甘。能补脾益气,清热解毒,止咳祛痰、缓急定痛、调和诸药 等功效。有“阁老”之称,解百毒的作用。现代研究含主要成分有三萜类化合物 (甘草甜素亦甘草酸盐,甘草酸等) ,黄酮类化合物 (甘草黄碱酮,异甘草黄铜,甘 草素等) 及甘草多糖类化合物等三大类。现代药理学研究表明,甘草具有保肝、 抗炎、抗菌、抗病毒、镇咳、抗疟,抗氧化、抗癌、免疫调解、降糖和抗血小板 凝集等多种活性 1。 甘草的主要成分甘草酸及甘草次酸，有诸多药理作用。第一、甘草次酸和 甘草酸对消化系统有作用，可治疗上消化道溃疡

9、，抑制胃酸分泌，当肠管处于 痉挛状态时,则有明显的解痉作用。 2-3第二、具有抗炎作用，研究认为甘草次 酸对大鼠棉球肉芽肿、甲醛性浮肿、结核菌素反应、皮下肉芽肿性炎症均有一 定的抑制作用. 将它试用于各种皮肤病的治疗,通过许多临床试验,确证了其抗 炎的有效性. 如32氨基2112脱氧甘草次酸对各类动物的无菌性关节炎表现出明 显的抗炎活性. 甘草次酸衍生物的抗炎作用与其对蛋白激酶的影响有关,其机制 可能与它们能和蛋白激酶结合,进而抑制蛋白激酶与ATP结合,最终抑制了多肽磷 酸化反应有关 4-5 .第三，具有抗病毒作用，甘草酸类化合物通过对多种病毒 颗粒的直接作用和诱生干扰素,增强天然杀伤细胞和巨

10、噬细胞的活性等活化宿主 免疫功能的间接作用,而发挥广谱病毒作用。是一种有发展前景的抗病毒药物 6。 第四、具有抗菌作用，甘草的醇提取物及甘草酸钠在体外对金黄色葡萄球菌,结 核杆菌,大肠杆菌,阿米巴原虫均有抑制作用 7。第五、国外文献曾经报道甘草 次酸钠有降低胆固醇,B- 脂蛋白及甘油三酯水平, 有抗动脉粥样硬化的作用。 为了开辟调血脂用途, 孟富敏等人通过实验观察甘草次酸钠对正常动物血脂的 影响 。实验结果表明甘草次酸钠可使动物血脂明显降低, 尤以甘油三酯,B- 脂 蛋白为甚, 但是胆固醇降低在用药前后无显著差异。从结果来看,孟富敏等人认 为甘草次酸钠有希望作为降血脂药，值得进一步研究 8。

11、第六、日本学者熊谷 朗研究证明甘草甙有破坏血管内爱滋病毒的作用, Hatano也报导了甘草具有抗 爱滋病毒的作用,这是一个好的开端,作为甘草的主要成分甘草次酸及其衍生物, 其中有可能会成为治疗爱滋病的新药 2 .第七、甘草次酸具有抗2萘基异硫氰 酸盐诱导的肝损伤作用具有肝脏保护作用 9 ,对注射CCl4导致的肝纤维化有一 定的缓解作用,可用于治疗肝纤维化 10。第八、有报道甘草次酸100mg/kg给豚 鼠肌肉注射, 10 min后,其短声引起的耳蜗微音电位和听神经动作电位振幅增大,听 神经动作电位反应阈值降低,这一实验表明表明甘草次酸具有提高豚鼠内耳听觉 功能的作用,有可能是其直接作用内耳的结

12、果 11。 但是, 临床上大量使用该类药物时常伴有类醛固酮多症(Pseu2doaldoster onism) , 其特征是钠潴留、钾排泄量增加, 引起水肿、高血压、低血钾等一系 列的副作用。另外, 也有报道甘草次酸能引起动物甲状腺中度抑制, 有降低基 础代谢率的作用1 4, 52。而且水溶性差以及高浓度时对正常细胞的毒性制约了 其在临床上的应用。为了克服或减轻这些副作用以及改善甘草次酸的溶解性、 吸收性和有利于制成合适的剂型, 国内外的学者对其结构进行修饰和改造, 设 计了一系列的甘草次酸衍生物1 62。并以此为依据, 为进一步寻找高效、低毒、 副作用小的新药成分, 以充分发挥甘草的药用价值。

13、 甘草次酸3 位上羟基被取 代后抗炎活性、抗溃疡活性较为显著。 甘草次酸 3 位、30 位分别或同时成酯, 其衍生物具有较高的抗炎活性。甘草次酸30 位成酰胺后具有较理想抗胃溃疡活 性。甘草次酸的不良反应主要是因为11- 位羰基的存在 , 11- 位羰基脱去后不 但可以消除或减弱其副作用, 增强药理活性而且有表现出强的抗溃疡、抗变态 及抗炎活性。对甘草次酸同时或分别于23、28 位上一个羟基后, 形成的衍生物 显示出显著的抗肿瘤增生活性 12。杨晓辉等根据甘草次酸的构效关系, 以甘草 次酸为原料, 合成了氨基酸类化合物或咪唑杂环类化合物与甘草次酸结构单元 构筑的N - 乙酰氨基乙酸甘草次酸酯(

14、 ) 3、N -乙酰- DL- A- 氨基丙酸甘 草次酸酯( )、N - 乙酰- DL- 蛋氨酸甘草次酸酯( )、咪唑- 4 - 羧酸- 5- 甘草次酸酯( ) 和咪唑- 4 - 羧酸- 5 -( 11- 脱氧甘草次酸)酯( )等5种甘 草次酸3位酯类衍生物, 并以波谱数据确定其结构, 以二甲苯引起的小鼠耳肿胀 模型评价其抗炎活性。结果表明,所合成的甘草次酸3位酯类衍生物对二甲苯致 耳肿胀具有明显的抑制作用, 其抗炎活性与氢化可的松相近, 且化合物、 的抗炎活性还高于氢化可的松 13。而哌嗪环是药物化学研究中常用的一类碱性 基团，其毒性小，易形成多个氢键或离子键，常能有效地调节药物的脂水分配

15、系数和酸碱平衡常数。将其引入分子，能有效地增加分子的碱性和水溶性，从 而增强分子的活性。因此，在一定程度上，哌嗪基团是一个增效基团，常在许 多药物的设计和开发中引入。研究表明，含哌嗪且N-取代的化合物常显示出广 泛的生物活性，如抗微生物、抗高血压、抗癌、消炎和止痛等 14。本文主要对 宁夏大学化工学院研制的含哌嗪环的甘草次酸衍生物是否具有抑制肝癌细胞的 作用进行研究。利用细胞计数法，倒置显微镜法，MTT法，oecHhst-33258染色 法，流式细胞法观察和研究经不同浓度18-甘草次酸衍物作用24h，48h和72h 的肝癌细胞SMMC-7721的形态结构，生长抑制率,细胞凋亡的变化，并探究了对

16、 SMMC-7721影响的最适18-甘草次酸衍物的浓度。研究发现经不同浓度的18- 甘草次酸衍物作用后的SMMC-7721，经显微镜观察显示:细胞的形态发生改变， 出现膨胀或皱缩现象；通过MTT检测表明细胞的增殖抑制率随18-甘草次酸衍 物浓度的增加而增加，随着作用时间的增长而增加，通过，Hoechst-33258试剂 盒染 色法研究表明18-甘草次酸衍物还可影响细胞的凋亡。 1.实验用品 1.1 仪器 4冰箱、液氮罐、离心机、微量移液器、冻存管、离心管、倒置显微镜、 CO2培养箱、超净工作台、培养皿、废液缸、血细胞计数板、96 孔板、酶标仪、 荧光显微镜、6 孔板、盖玻片、载玻片、过滤器 1

17、.2 试剂 1640 培养基、青霉素、链霉素、0.25胰酶、小牛血清、DMSO 溶液、 0.9NaCl 溶液、MTT 溶液、75乙醇 2.试验方法 2.11640 培养基的配置 2.1.1 过滤器的准备和安装 清洗好过滤器，干燥，放入一张 0.22um 微孔滤膜用布包装好 101kp121进 行高压灭菌处理。在超净工作台内安装好过滤装置，准备过滤。 2.1.21640 培养基的配置 1.）向 1640 原液中加入 10%的已灭活的小牛血清和 1%的双抗.(青霉素 100u/ml,链霉素 100ug/ml) 2.）容量瓶定容 3.）过滤法除菌 4.）分装于玻璃瓶中，4 度冰箱保存备用 2.2 细

18、胞复苏 1.)细胞实验室进行常规消毒，紫外灯照射 30 分钟以上 2.）将 1640 培养液和 0.25%胰蛋白酶放入培养箱中预热 20 分钟 3.）从液氮中取出冻存细胞放入 37的水浴中，快速摇晃，直至冻存液完 全溶化 4.）将细胞悬液移入 15ml 离心管中，缓慢加入 4ml 培养液，离心 （1000ran/min,5min） 5.）用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度。 6.）放入 37 度 5%的 CO2培养箱中培养. 2.3 细胞传代 1.）细胞实验室进行常规消毒，紫外灯照射 30 分钟以上 2.）将 1640 培养液和 0.25%胰蛋白酶放入培养箱中预热 20 分钟 3 观）察贴

19、壁细胞 4.)吸去培养皿中原来的培养液，生理盐水清洗 5.)加入 1.5ml，0.25%胰蛋白酶消化细胞 6.)轻轻地晃动培养皿，使贴壁细胞都漂起来 7.)室温消化 1 至 3min，在倒置显微镜下观察细胞 8.）当原贴壁细胞逐渐趋于圆形时，加入等体积培养液终止消化 9.）用吸管贴壁细胞吹打成悬液，移入离心管中离心（1000rfm,5min） 10.）弃去上清液，加入 2ml 培养液，重悬沉淀，平均分到 2 个培养皿中再 向每个培养皿中加入 9ml 培养液 11.）置 37、5%的培养箱中培养 12.）第二天观察细胞生长情况 注意事项 1）传代细胞时注意严格的无菌操作，并防止细胞间的交叉污染。

20、 2）酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞会对细胞造成损害，消 化不够则难以将细胞解离下来。 3）传代后每天观察细胞生长情况，了解细胞是否健康生长：健康的细胞形 态饱满，折光性好。 4）掌握好传代时期：健康生长的细胞生长致密，即将铺面皿底时，即可传 代。 2.4 细胞冻存 1）冷冻前 24-48h 更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清， 逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至 20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下 待用。 3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮 液(约 0.1ml)计数

21、细胞浓度及冻前存活率。 4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制 成细胞冻存悬液（DMSO 最后浓度为 510） ，使细胞浓度为 15106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中， 12ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、 代数、日期。然后进行冻存。 5）冷存管置于 410 分钟-2030 分钟-801618 小时(或隔夜) -液氮槽 vaporphase 长期储存。 注意事项 1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase) 且存活率高之状态，约为 8090致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质。 2）

22、细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70 度可 保存数月。 3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色 以 510ml 小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。本方法中先制备双倍冻存 液，可避免 DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液 是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。 2.5 利用 MTT 法检测 18-甘草次酸衍生物对肝癌细胞的抑制率 MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶 甲瓒（Formazan）并沉积在细胞

23、中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO） 能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可 间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正 比。 2.5.1 试剂配制 称取 MTT 0.5 克，溶于 100 ml 的磷酸缓冲液（PBS） ，用 0.22m 滤膜过滤 以除去溶液里的细菌，放 4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最 好用铝箔纸包住，防止见光分解 2.5.2 细胞计数 1)将血细胞计数板及盖片擦拭干净，并将盖片改在计数板上 2）取吸管一支，伸入培养瓶中轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后立 即吸细胞悬液少许，向另一离心

24、管中滴入细胞悬液九滴，混匀置 2 到 3min. 3）把计数板平放在显微镜台上，立即从细胞板边缘轻轻滴 1 至 2 滴细胞悬 液，使之充满计数板和盖片间空隙中。 4)镜下观察细胞，计算四角大方格内的细胞数，压中线着只计算左线和上线 者，有线和下线不计算在内，然后按以下公式计算： 细胞密度（个/mi）=平均细胞数10 4稀释倍数 细胞总数（个）=细胞浓度细胞悬液量 2.5.3 利用 MTT 法检测 18-甘草次酸衍生物对肝癌细胞的抑制率 1)先将过 18-甘草次酸衍生物用 DMSO 配制成一定浓度的贮备液，临用前用 培养液稀释成不同浓度梯度备用。 2)取处于对数生长期，状态良好的肝癌细胞，吹散成

25、单细胞悬液，计数后， 以 3103个/孔接种于 96 孔板，每孔 100l。 3)培养过夜后弃上清，分别加入各浓度梯度的待测药物每孔 100l。每个药 物浓度设置 5 个平行孔，同时设空白及对照组。 4）继续培养 24h、48h、72h，每孔加 MTT 溶液（5mgml-1）20l，再培养 4 小时。使 MTT 还原为甲月赞 5）小心吸弃孔内上清液，每孔加 150l DMSO，慢速振荡 10min，使结晶物 充分溶解。 6）酶标仪在 492nm 波长处测每孔的光密度 2.6 用 18-甘草次酸衍生物作用肝癌细胞后进行显微镜观察 通过 MTT 法，选择对肝癌细胞作用比较好的药物，稀释成上述不同的

26、浓度 梯度，取处于对数生长期，状态良好的肝癌细胞，吹散成单细胞悬液，计数后， 以 3103个/孔接种于 96 孔板，每孔 100l。培养过夜后弃上清，分别加入各 浓度梯度的待测药物每孔 100l。每个药物浓度设置 5 个平行孔，同时设对照 组，继续培养 24h、48h、72h，把通过药物处理的肝癌细胞和对照组细胞制成 装片，利用显微镜观察对肝癌细胞的影响。 2.7 利用 Hoechst-33258 细胞凋亡染色试剂盒检测细胞凋亡情况 1）取洁净盖玻片在 75 乙醇中浸泡 5 分钟，或更长时间，无菌超净工作台内 吹干，或用 0.9%的 NaCl 溶液漂洗三遍，再用细胞培养液洗涤一遍，将盖玻片 置

27、于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为 50%至 80%满。 2）向培养过夜的细胞中每孔加入浓度为 100ug/ml 的各种药物 5ml，分别培 养 48 小时、72 小时。 3）吸尽培养液，加入 0.5 毫升固定液，固定十分钟，或更长时间。 4）去固定液，用 0.9%的 NaCl 洗两遍，每次三分钟，吸尽液体，洗涤时易 用摇床，或手动摇晃。 5）加入 0.5mlHoechst-33258 染色液，染色 5 分钟，也宜用摇床 6）去染色液，用 0.9%的 NaCl 洗两遍，每次 3 分钟，吸尽液体。洗涤时易 用摇床，或手动摇晃。 7）滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞

28、 接触封片液，尽量避免气泡。 8）荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长为 350nm 左右，发射波 长为 460nm 左右。 注意事项 1）荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品需避光保存。 2）在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍易尽量避光。 3）需戴一次性手套操作。 3.结果与分析 3.1MTT 法检测 18-甘草次酸的衍生物对肝癌细胞的增殖抑制作用： 实验结果如下： (1) D33 对肝癌细胞的抑制率（%）(表 1) 24H 48H 72H 0gml-1 0 0 0 3.125gml-1 -64.53 -42.66 15.52 6.25gml-1 -68.87 -27.96 3

29、1.94 12.5gml-1 -87.62 -45.84 24.06 25gml-1 -95.95 -3.8 57.1 50gml-1 -225.46 -10.49 32.76 100gml-1 -86.31 1.7 41.25 表 1 (2)D34 对肝癌细胞的抑制率（%） （表 2） 24H 48H 72H 0gml-1 0 0 0 3.125gml-1 -1650.82 44.83 52.66 6.25gml-1 -1450.35 47.58 67.98 12.5gml-1 -1147.53 54.73 64.36 25gml-1 -1214.59 60.37 78.75 50gml-1

30、 -1170.11 68.05 62.03 100gml-1 -843.99 72.19 82.63 表 2 (3)D35 对肝癌细胞的抑制率（%） （表 3） 24H 48H 72H 0gml-1 0 0 0 3.125gml-1 -388 37.29 34.17 6.25gml-1 -2041.18 52.79 51.03 12.5gml-1 -2041.18 47.13 30.89 25gml-1 -1808.24 64.53 61.03 50gml-1 -1302.12 55.98 44.36 100gml-1 -1133.24 70.74 76.4 表 3 (4)D28 对肝癌细胞的

31、抑制率（%） （表 4） 24H 48H 72H 0gml-1 0 0 0 3.125gml-1 16.73 36.97 41.56 6.25gml-1 22.59 14.48 9.75 12.5gml-1 25.33 17.7 32.97 25gml-1 20.25 9.94 88.52 50gml-1 31.34 21.86 28.93 100gml-1 34.9 41.18 68.59 表 4 (5)DGA 对肝癌细胞的抑制率（%） （表 5） 24H 48H 72H 0gml-1 0 0 0 3.125gml-1 24.44 -8.62 38.35 6.25gml-1 33.65 13

32、.23 35.96 12.5gml-1 47.93 19.16 19.16 25gml-1 19.16 40.56 54.15 50gml-1 19.82 56.34 64.73 100gml-1 56.42 95.16 97.7 表 5 根据以上五种不同药物不同浓度不同时间段的比较，发现五种药物的比较 好的的作用时间是 72H，我们对 72H 时不同药物对肝癌细胞的抑制率（%）进行 比较，结果如下：（表 6，图 1） 3.125gml -1 6.25gml -1 12.5gml -1 25gml- 1 50gml- 1 100gml- 1 d33 15.52 31.94 24.06 57.1

33、 32.76 41.25 d35 52.66 67.98 64.36 78.75 62.03 82.63 d34 34.17 51.03 30.89 61.03 44.36 76.4 d28 41.56 9.75 32.97 88.52 28.93 68.59 dga 38.35 35.96 19.16 54.15 64.73 97.7 图 2 五种药物不同浓度 72h 抑制率比较 由实验结果表明：同一浓度的同一药物作用时间越长，对细胞增殖的抑制 率越大，72H 和 48H 的抑制率接近但明显大于 24H 的。且有的药物在 24H 和 48H 时对药物对细胞的抑制率为负值，则说明药物是在 24

34、 或 48 小时之后才起作用 的，从整体看，可以判断药物在浓度为 100 g/mL 作用时间为 72h 时发挥作用 最大，并持续作用，且抑制率与时间、剂量呈明显正相关，况且不同的药物在 相同时间的条件下对肝癌细胞的抑制率也不相同，不同的药物对细胞的抑制都 有一个最适的浓度和最适时间。 3.218-甘草次酸衍生物对肝癌细胞形态结构的影响 通过 MTT 法发现 D35 的药理作用最强，用不同浓度的 D35 对对数生长期状 态良好的肝癌细胞进行不同时间段的处理，并与未处理的细胞做对照，在电镜 下观察发现，未处理的细胞细胞结构正常，细胞光滑，无棱角，细胞形态正常， 未出现膨胀和皱缩现象；实验组细胞结构

35、变化多样，有的细胞皱缩，有的细胞 膨胀，细胞有明显的棱角，结果表明 18-甘草次酸的衍生物对肝癌细胞的细 胞形态有明显影响，使细胞的细胞核发生崩解和皱缩，抑制了细胞的生长。 （图 1） D35-100-20X10-24H D35-50-20X10-24H D35-25-2X1-24H D35-12.5-20X10-24H D35-6.25-20X10-24H D35-3.125-20X10-24H D35-100-20X10-48H D35-50-20X10-50-48H D35-25-20X10-48H D35-12.5-20X10-48H D35-6.25-20X10-48H D35-3.

36、125-20X10-48H D35-100-20X10-72H D35-50-20X10-72H D35-25-20X10-72H D35-12.5-20X1-72H D35-6.25-20X10-72H D35-3.125-20X10-72H 空白-24h 空白-28h 空白-72h 图 2 细胞形态图 3.318-甘草次酸的衍生物对肝癌细胞凋亡的影响 用细胞凋亡-Hoechst33258 染色试剂盒处理后，置荧光显微镜下观察细胞形态的变化。 正常细胞的细胞形态完整并呈正常的亮蓝色，而凋亡细胞的细胞膜破碎，而且有的细胞核 也呈碎块状，颜色有些发白。并且随着时间的增加细胞数量在减少。这说明 1

37、8-甘草次酸 的衍生物对肝癌细胞有诱导其凋亡的作用。 D35-20X10-48H 空白-20X10-48H G H I G H I D35-40X10-48H 空白-40X10-48H D35-20X10-72H 空白-20X10-72H D35-40x10-72h H 空白-40X10-72H 图 3 Hoechst 细胞凋亡图 4.结论 用含 18-甘草次酸衍生物的细胞培养液对肝癌细胞 SGC-7901 进行培养后， 我们用电子显微镜镜检发现，经过 18-甘草次酸衍生物处理后，肝癌细胞的 形态发生改变，出现膨胀或者缩小，可能是由于 18-甘草次酸衍生物对其产 生了影响；通过 MTT 法检测

38、细胞的生长抑制率发现，同一浓度的同一药物作用 时间越长，对细胞增殖的抑制率越大，72H 和 48H 的抑制率接近但明显大于 24H 的。且有的药物在 24H 和 48H 时对药物对细胞的抑制率为负值，则说明药物是 在 24、48 小时之后才起作用的；用 Hoechst-33258 细胞凋亡试剂盒检测细胞的 凋亡情况，研究数据表明，随着 18-甘草次酸衍生物浓度的增加，肝癌细胞 的凋亡率不断增加，在 18-甘草次酸衍生物浓度达到 100g/ml 时，凋亡细胞 比例最大，说明 18-甘草次酸衍生物可以促进肝癌细胞的细胞凋亡，随着 18-甘草次酸衍生物浓度的增加，凋亡比例也随之增加。从以上研究表明

39、18-甘草次酸衍生物对于肝癌细胞细胞增殖和细胞凋亡都有很大的影响，它能 够很好的抑制细胞生长，控制细胞增殖，促进细胞凋亡，该研究为宁夏甘草抗 肿瘤的深入研究及应用于临床肝癌防治提供了重要的理论依据。 参考文献 1胡志厚. 甘草酸类药物的研究及应用 J . 药学学报, 1988; 23 (7) : 5532560 2中村理惠 1 甘草中抗溃疡作用的主要成分J 1 国外医学(中医中药分册) ,2005 ,27 (1) :501 3陈红.甘草药理作用概述J.海峡药学，2005,17（4）：39 4Lee C H. Protective mechanism of glycyrrhizin on acu

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