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1、色谱技术,如何选择最佳分离条件,一、色谱的任务,色谱的首要任务是分离 关键在于建立色谱分析方法优选最佳色谱分离条件 为此要了解影响分离度的因素 掌握建立色谱分析方法优化色谱分离条件的一般步骤,二、衡量分离的指标分离度,分离度：Rs=1.5 基线分离完全分离,二、影响分离度的因素,受动力学因素和热力学因素两方面的影响 基本分离方程,效率因子,选择性因子,容量因子,1、效率因子(n),当固定相确定以后，要使一对组分的分离达到某一分离度，柱必须具有最低限度的理论塔板数(最小柱长)。 增加柱长可以提高分离度。 减小柱的H可以提高分离度，比增加柱长更可取。,2、容量因子(k),容量因子(k)增加，Rs增
2、加。 K合适的范围：120 使k改变的方法有；改变柱温；改变流动相性质及组成(在液体色谱中)；改变相比。,3、选择性因子(),越大，柱选搀性越好，越能获得良分离 三个参数中，的增加对分离度的提高最有效 改变方法：改变固定相、改变流动相、改变柱温、改变样品结构衍生化,三、如何提高柱效,基本概念：理论塔板数n，理论塔板高度H 板高(H)越小，柱效(n)越高，峰宽(W)越窄 影响柱效的因素速率理论 H=A+B/u+C*u,1、涡流扩散项(A),当组分随流动相向往出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒的阻碍不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，导致谱带展宽，故称涡流扩散。 采
3、用小颗粒固定相，填充均匀可提高柱效,填充不规则因子,固定相颗粒直径,2、纵向扩散(B),纵向分子扩散指沿X轴方向的扩散，它是由浓度梯度造成的。 H2=k*Dm Dm组分分子在流动相中的扩散系数 与流动相流速成反比,3、传质阻力项(C),组分分子在两相之分配时受到的阻力 流动相中的传质阻力Cm=K*dp2/Dm 液相色谱中减小流动小粘度可以增大Dm,3、传质阻力项(C),固定相的传质阻力Cs=K*df2/Ds 减小液膜厚度 减小固定液粘度 H3=Cm+Cs 键合项液相色谱中Cs可以忽略 气相色谱中Cm可以忽略,4、速率方程,H=A+B/u+C*u 操作条件,5、其他导致峰展宽的原因,拖尾的原因,
4、6、保护色谱柱,四、改变组分k和,液相色谱：改变流动相 正相色谱吸附色谱(薄层色谱) 反相色谱键合相色谱、反相离子对色谱(HPLC) 气相色谱： 毛细管色谱柱温、 固定液,1、调节组分k值,液相色谱通过改变流动相极性调节组分k值。 溶剂极性与洗脱能力： 正相色谱极性强洗脱能力强，组分k减小 反相色谱极性弱洗脱能力强，组分k减小 各种溶剂的极性0、P 混合溶剂的极性,2、改变选择性(),根据分子间作用力将溶剂分组 不容组的溶剂选择性不同 根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性,五、确定最佳溶剂强度,一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k。当所有谱峰符合1k
5、20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度),五、确定最佳溶剂强度,另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k值符合1k20范围的大概溶剂成分。,六、优化流动相的选择性,三角形优化法(反相HPLC),正相色谱,七、离子对色谱法,离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术 关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。,1、基本原理,有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相
6、反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。离子对的生成可由下式表示： A-水相B+水相A-B+有机相分别表示组分离子A-、平衡离子B+、离子对A-B+有机相在水相和有机相中。,1、基本原理,由于离子对具有硫水性，因而被非极性固定相(即有机相)提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。 以上这类色谱法称反相离子对色谱法。,能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可
7、离解的多宫能团化合物的分离。 可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。,2、反相离子对色谱法,固定相和流动相 在反相离子对色谱中，采用类似于反相键合相色谱中所使用的固定相。 流动相为加有平衡离子和有机溶剂(如甲醇或乙腈)的缓冲水溶液。平衡离子为四丁铵、烷基磺酸盐等。,3、影响保留值的因素,离子对试剂 若组分离子和平衡离子只溶于水相，生成的离子对只溶于有机相，则离子对生成反应的平衡常数(又称提取常数)，可表示为： 对于某一特定的离子对分配体系，E为常数，但它随着流动相的PH值、离子强度、流动相中有机溶剂浓度和种类、温度的改变而变化。,离子对试剂 组分离子在两相问的分配系数可表示为
8、： 可见，分配系数与提取常数和平衡离子的浓度成正比。,组分离子的保留值受离子对的疏水性和平衡离子的浓度所控制。离子对疏水性越强，在非极性固定相上的溶解度越大，则保留值越大。平衡离子浓度增加，有利于离子对的形成，保留值也随之增加。但是，当所有组分离子都以离子对形式存在时，保留值为一常数。,溶剂强度 通过改变混合流动相中的溶剂的相对比例，可以改变溶剂强度。流动相中水的比例减少，有机溶剂(如甲醇或乙腈)增加，溶剂强度增加，k值减少。,pH值的影响 以酸为例：在中等pH值内，组分具有最大的k值。在此范围内，组分完全离解，形成的离子对最多。当pH值降低阴离子开始形成酸分子，因此，进入固定相的离子对减少，
9、组分k值减小。当流动相pH值较高时，OH-离子很多，它们会与组分离子争夺平衡离子，以形成离子对，使组分离子形成的离子对减少，组分的k值下降。,离子强度 除平衡离子外，若流动相中还存在其他辅助离子，则使离子强度增加，组分的k值下降。离子强度加倍，k值大致变化23倍。当辅助离子浓度增加时，会发生两种情况：若辅助离子与组分离子的电性相同，它们为争夺平衡离子而展开竞争；若平衡离子与辅助离子的电性相同，它们为争夺组分离子而展开竞争。,4、改变选择性,改变溶剂种类 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。,改变pH 组分离子与平衡离子的
10、生成，离子对的形成，都与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐)和强碱盐(季铵盐)才满足此要求。,酸性越强的组分(A)在较大的pH范围内，k都保持极大值。酸性越弱的组分(C)，只有在极窄的pH范围内，k才有极大值。对于强酸性组分，只有当pH小于1时，才迅速流出柱子，对于弱酸性组分，pH值小于5，就能迅速流出柱子。假如A、B、C同时存在，流动相的pH值为8，则三组分都强烈滞
11、留于拄上，不能分离。若pH调至4，三者完全分离。C最先出柱，A最后出。可见，正确选择流动相的pH值是改善选择性的强有力手段若预先知道酸或碱的值pK，就可以预测组分的相对保留值怎样随pH值而改变。,系统选择 使用一种有机溶剂(甲醇)；流动相的其它三种成分为pH=2.5(B)和pH=7.5(c)的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如：200mM)的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(BD)进行七次实验，并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k值范围大致恒定。,八、梯度洗脱,梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使，已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以
12、上)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。 梯度期间，强溶剂B(如反相HPLC中的甲醇)的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作B 。,梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k范围宽，不能用等度方法简单地处置。,优化梯度条件： 起始B% 终止B% 梯度时间tG 溶剂B的种类,提高重现性： 色谱柱的平衡时间 溶剂 不同的设备,九、气相色谱相关技术,毛细管柱是将固定相涂在管内壁的开口
13、管，其中没有填充物，毛细管柱的内径从0.1 到0.5 毫米，典型的柱长是30 米。 柱效高(A=0) 分析速度快 样品用量少 柱容量小,分流进样及尾吹技术 分流进样毛细管柱有较小的样品容量，进样量必须非常少，通常远少于1微升以防止色谱柱超载，如此小的样品量操作起来是很困难的，分流模式提供了一种方法来解决此问题，采用通常的进样量气化，然后只把其中一部分引入到色谱柱内进行分析，其余大部分经分流出口放空。 不分流进样此模式特别适用于低浓度的样品，它将样品捕集在柱头，同时将残留在进样口的溶剂气体放空。 尾吹降低检测器的柱外效应 调节柱流量及分流比 分流比=分流出口流量:柱流量,十、气相色谱实验条件的选
14、择,色谱柱(固定液)的选择 原则：最难分离的物质达到要求的分离度，且分析时间适宜 “相似性原则”选择固定液 按极性选择 非极性组分非极性固定液，组分按沸点顺序出柱，低高（色散力） 中等极性组分中等极性固定液（色散力、诱导力）基本按沸点出柱，对沸点相同的极性、非极性组分，诱导力起主要作用，非极性先出柱 强极性组分强极性固定液，按极性顺序出柱（定向力）,按化学官能团选择 当所选固定液分子具有与组分分子相同的官能团时，相互作用力最强，选择性高。 如：分析酯类化合物，用酯或聚酯类固定液，分析醇类化合物，用聚乙二醇等醇类固定液 按主要差别选择 若组分主要差别是沸点，选非极性固定液 若组分主要差别是极性，
15、选极性固定液 例：分离苯（80.1）和环己烷（80.7）沸点相差0.6则用非极性固定液（填充柱）分不开，用中等极性固定液，则tR, 苯 =1.5 tR, 环己烷，用强极性固定液，则tR, 苯 =3.9 tR, 环己烷,柱温的选择 影响因素：K，k，Dm，Ds 降低柱温优点 K，增加固定相的选择性 Dm，降低了组分在流动相中的纵向扩散，减少固定液的流失，延长柱寿命，降低检测器本底 降低T的缺点 T，则Ds，Cs（传质阻抗）峰展宽 tR，分析时间,综上，在使难分离物质对达到需求的分离度条件下，尽可能采用低柱温 对于宽沸程的样品程序升温(单阶程序升温多阶程序升温) 在分析过程中柱温随时间而变化，通常
16、是升高柱温。 它的优点是 减少分析时间， 整个分离过程中峰形一致,检测和测定更容易。 缺点：样品组分将经历比恒温分离更高的温度这可能会导致某些敏感组分降解，在两次进样之间柱温箱必须冷却到初始温度这样就抵消了部分所节省的分析时间。 初始温度、初始时间、升温速率、终止温度、终止时间,与恒温GC的比较,与恒温GC的比较,程序升温,1 初温 程序升温中初温的选依据是： (1)样品组分的挥发性，一般初温选择低于样品中主要挥发组分的沸点温度； (2)固定相的粘度，初温应高于固定相的凝固温度。 对于未知样品，一般初温可选用室温。,2 终温 在程序升温分析时终温主要依据下述两点来进行选择： (1) 样品的稳定性， (2)高沸点组分的保留温度和固定液的最高使用温度 。 3 升温速率 升温速率快：分离度降低，分析时间缩短。,