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1、第十三章 核酸的酶促降解和核苷酸代谢,本章讨论核酸酶的类别和特点，对核苷酸的生物合成和分解代谢作一般介绍。,第一节 核酸的酶促降解,第三节 核苷酸的合成代谢,第二节 核苷酸的分解代谢,第一节 核酸的酶促降解,核苷酸酶 核苷磷酸解酶 核酸 核苷酸 核苷 碱基+核糖-1-P,磷酸,核酸酶,核苷水解酶,碱基+核糖,核 酸 酶,1、核酸酶的分类,（1）根据对底物的 专一性分为,（2）根据切割位点分为,2、核酸酶的特异性 3、限制性内切酶,外切核酸酶对核酸的水解位点,5,OH,B,3,B,B,B,B,B,B,B,牛脾磷酸二酯酶（ 5端外切5得3）,蛇毒磷酸二酯酶（ 3端外切3得5）,内切核酸酶对RNA的
2、水解位点示意图,RNAase I,RNAase I,RNAase T1,RNAase T1,Pu ：嘌呤 Py：嘧啶,限制性内切酶, 类型 命名和意义 限制片段的长度 限制图,原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。,常用的DNA限制性内切酶的专一性,酶,辨认的序列和切口,说明, A G C T T C G A , G G A T C C C C T A G G , A G A T C T T C
3、T A G A , G A A T T C C T T A A G , A A G C T T T T C G A A , G T C G A C C A G C T G , C C C G G G G G G C C C ,Bam H I,Alu I,Bgl I,Eco R I,Hind ,Sal I,Sma I,四核苷酸，平端切口,六核苷酸，平端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,限制性内切酶类型,I型：分子量大于105，多亚基，需S-线苷蛋氨酸、ATP和Mg2+ ，识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限制与修饰相
4、排斥的多功能酶.,型：分子量小于105，需Mg2+ ，切割位点位于识别 位点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物学研究所用的限制性内切酶均为此类。,I型：识别位点为5-7bp的非对称序列 ，切割位点在顺序之外离识别 序列5-10bp，切割双链，个别也切割单链。是限制与修饰相多功能酶.,限制性内切酶的命名,Eco R I,序号,属名,种名,株名,例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶,Hind,例：流感Haemophilus influengae d,（属名）,（种名）,（株系）,I 特异性甲基化酶 IIGTPyPuAC III AAGCT
5、T,限制性内切酶的意义,限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。,限制片段的长度,根据估算，识别六核苷酸顺序的的限制酶大约在4096（46）个硷基对长的DNA分子中有一个切点，而通常大多数肽链的不超过1000氨基酸残基。因此，由识别六核苷酸顺序的的限制酶产生的DNA片段接近一个原核生物基因的大小，这个性质使得这些限制酶可以用于建造和克隆有用的重组DNA分子。 为了获取更大的DNA片段，可以采用限制酶部分降解的方法，也可以选用识别810个核苷酸顺序的限制酶。,限制图的定义和构建
6、,限制图（亦称物理图谱）是DNA的限制性内切酶酶解片断沿DNA分子的物理位置的排列顺序以及各片断的相对长度和绝对长度。 由于限制性内切酶能在独特顺序切割双链DNA产生大的DNA片段，它们提供了一种以碱基对为单位距离给DNA分子作图的方法，在确定DNA分子一级结构的过程中，限制图的构建是一项必不可少的工作。 限制图制作方法示例：末端标记单酶切法,SV-40基因组限制性酶谱,SV-40病毒基因组限制性物理图谱,末端标记法绘制物理图谱, 将待测DNA分子的一端用放射性同位素标记，部分酶解； 电泳分离，只有带同位素的片段出现在放射自显影图上；. 分析：放射自显影图上谱线的数目相当于完全酶解片段的数目；
7、 相邻谱线碱基对数目之差就是两个相邻点之间这段DNA片段的大小。,例：某组蛋白基因片段共5900bp，末端标记后用HpaII部分酶解得到五个片段，分子量分别为：5900bp；4210bp；3260bp；2950bp；1020bp。画出该DNA分子的物理图谱。,限制性内切酶解法,部分酶解法 将待测DNA用限制性内切酶完全水解，电泳后得完全酶解图谱. 再将待测DNA进行部分酶解(限制酶量、降低温度、缩短反应时 间),电泳后获得部分酶解图谱. 对完全酶解和部分酶解片段长度进行比较分析，根据片段重叠原 理组建物理图谱.,例：有一 174经Hind II酶解所得片段，分子大小为1030bp，其用Alu
8、I完全水解得四个片段：A 750bp，B 150bp，C 80bp，D 50bp；用Alu I部分水解得三个片段：800bp，230bp，130bp。请推断A、B、C、D的排列顺序。,第二节 核苷酸的降解,二、嘧啶的降解,一、嘌呤的降解,核苷酸酶 核苷磷酸化酶 核苷酸 核苷 碱基+（脱氧）戊糖-1-P,磷酸,嘌呤的分解及“痛风症”产生和治疗,尿囊酸,尿素,CO2+NH3,腺嘌呤脱氨酶,黄嘌呤氧化酶,尿酸氧化酶,黄嘌呤氧化酶,鸟嘌呤脱氨酶,腺嘌呤,次黄嘌呤,黄嘌呤,鸟嘌呤,尿囊素,尿酸,嘧啶的分解,胞嘧啶,尿嘧啶,胸腺嘧啶,二氢尿嘧啶,二氢胸腺嘧啶,-脲基丙酸,-脲基异丁酸,-氨基异丁酸,-丙氨
9、酸,第三节 核苷酸的合成代谢,一、核糖核苷酸的生物合成,二、脱氧核糖核苷酸的生物合成,三、各种核苷酸的相互转变,核糖核苷酸的生物合成,1、嘌呤核苷酸的生物合成,(1) 从头合成途径,(2) 补救合成途径(自学),2、嘧啶核苷酸的生物合成,(1) 从头合成途径,(2) 补救合成途径(自学),嘌呤环上各原子的来源,来自谷氨酰胺的酰胺氮,来自“甲酸盐”,来自天冬氨酸,来自甘氨酸,来自CO2,来自“甲酸盐”,IMP的 生物合成,5-磷酸核糖焦磷酸,5-磷酸核糖胺,甘氨酸,甘氨酰胺核苷酸,甲酰甘氨酰胺核苷酸,甲酰甘氨咪核苷酸,5-氨基咪唑核苷酸,5-氨基咪唑-4-羧核苷酸,5-氨基咪唑-4-琥珀基-甲酰
10、胺核苷酸,5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,5-甲酰氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸,次黄嘌呤核苷酸（IMP）,甲酰THFA,IMP转变为GMP和AMP,嘌呤核苷酸合成补救途径（自学）,磷酸核糖转移酶,嘌呤+PRPP,A(G)MP+PPi,嘌呤+1-P-核糖,嘌呤核苷,A(G)MP,ATP ADP,嘧啶核苷酸从头合成途径,c、UMP转变为CTP,CTP,CTP合成酶,ATP,Gln,H2O,UMP,UDP,UTP,a、嘧啶环上原子的来源,b、UMP的从头合成,嘧啶环上各原子的来源,天冬氨酸,CO2,NH3,N,N,C,C,C,C,6,5,4,3,2,1,氨甲酰磷酸,尿嘧啶核苷酸合成途径,天冬氨酸,氨甲
11、酰天冬氨酸,二氢乳清酸,乳清酸,乳清苷酸,尿嘧啶核苷酸,氨甲酰磷酸,嘧啶核苷酸补救合成途径（自学）,尿嘧啶+PRPP,尿嘧啶+1-P-核糖,尿嘧啶核苷+ATP,UMP+PPi,尿嘧啶核苷+Pi,UMP+ADP,脱氧核苷酸的合成,2、脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成,1、脱氧核苷酸的合成,硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反应,核糖核苷酸还原酶,核糖核苷酸的还原反应,FAD,核糖核苷酸还原酶,ATP 、Mg2+,硫氧还蛋白还原酶,核糖核苷二磷酸,+ H2O,脱氧核糖核苷二磷酸,FADH2,NADP+,NADPH+H+,谷氧还蛋白还原酶,GSSG,2GSH,谷胱甘肽还原酶,硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反
12、应,核糖核苷酸还原酶示意图,底物特异性调节位点,酶活性 调节位点,催化部位,B1亚基,B2亚基,脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成,胸腺嘧啶核苷酸合成酶,NADPH+H+Ser,NADP+Gly,N5、N10CH2 FH4 FH2,二氢叶酸还原酶,Ser羟甲基转移酶,O,N,HN,O,dR-P,CH3,O,N,HN,O,dR-P,核苷酸合成前体类似物与抗癌、抗菌药物,根据酶的抑制原理，在癌症的化学治疗或抗菌治疗中，往往选用一些底物类似物（抗代谢物）抑制胸苷酸合成酶或二氢叶酸合成酶的合成，使胸苷酸不能合成，例如： 1、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、三甲氧苄氨嘧啶为叶酸类似物，是二氢叶酸还原酶抑制剂，可抑制癌细胞和细
13、菌生长； 2、5-氟脲嘧啶、 5 -氟脱氧脲嘧啶在体内可转化为5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸为脱氧胸腺嘧啶核苷酸类似物，是脱氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶的自杀性抑制剂（suicide inhibitor） ，可作为抗癌药物。,5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸作为胸苷酸合成酶自杀性底物的机理,胸苷酸合成酶、5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸和亚甲基四氢叶酸三元复合物的形成,叶酸和 四氢叶酸（FH4）,叶酸,N5，N10-CH2-FH4,一碳基团的来源与转变,S-腺苷蛋氨酸,N5-CH2-FH4,N5 N10 - CH2-FH4,N5， N10 = CH-FH4,N10 -CHO-FH4,N5 ， N10 -CH2-FH4还原酶,N5 ， N10 -CH2-FH4脱氢酶,环水化酶,丝氨酸,组氨酸苷氨酸,参与 甲基化反应,为胸腺嘧啶合成提供甲基,参与嘌呤合成,FH4,FH4,FH4,HCOOH,H2O,NAD+,NDAH+H+,NAD+,NDAH+H+,H+,参与嘌呤合成,核苷酸的合成及相互关系,再见,