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1、无菌检查法演示实验 抗生素室 易大为 辽宁省药品检验所,提纲,1.定义 2.常见检验品种 3. 4.培养基及培养基的适用性检查 5.稀释液以及冲洗液 6. 无菌检查法实例 7.方法学验证试验,1.定义:系指用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 的意义: 仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。,2.常见检验品种,注射剂 (水针、粉针、油乳注射剂） 眼用以及非注射产品 （手术、烧伤、严重创伤面给药制剂） 无菌封装的原料药 医疗器具和医用材料,3.培养基,硫乙醇酸盐流体培养基 3035 红色氧化层（h深度的1/5）， 100水浴加热除去氧化层， 时
2、间不超过20分钟 改良马丁培养基 2328,沸水浴 加热10min,灭菌后放置3天的培养基,4. 培养基的适用性检查 无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶）,培养14天,应无菌生长。 灵敏度检查 硫乙醇酸盐流体培养基 12ml，9支，4种菌，35 培养3天； 改良马丁培养基 9ml，5支，2种菌，25 培养5天。 结果判断:空白管应无菌生长,加菌管均生长良好 菌液制备（100 cfu/ml 的菌悬液）,生孢梭菌 64901,铜绿假单胞菌 10104,枯草芽孢杆菌 63501,金黄色葡萄球菌 26003,硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查 试验,5.稀释液以及冲洗液 0.1%蛋白胨水溶液 稀释
3、液 （如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤） 聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液 非水溶液制剂供试品的冲洗 十四烷酸异丙酯 膏剂和粘性油剂的溶剂 ，膜滤除菌,6.供试品的无菌检查,明确检验数量 与检验量 根据供试品的情况，确定检样数量 批出厂or上市抽检； 固体制剂or液体制剂； 直接接种法or薄膜过滤法 参考药典附录90-91页表1，表2，表3,检验流程：取规定量供试品,示例：红霉素眼膏无菌检查,十四烷酸异丙酯溶解,0.1%蛋白胨水溶液萃取,取水相作为供试液薄膜过滤,0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液冲洗薄膜,加培养基培养14天,上市抽检样品 膏剂和粘性油剂供试品 规格：2.5g：12.5mg红霉
4、素 薄膜过滤法（阳性对照增加1/2最小检验量） 依据以上的检品信息，查表3确定最少检验数量以及最少取样量,已知信息：,本品装量2.5g ：300mg M 5g 最少检验数量 供试品 + 阳性对照： 10 + 5 = 15 支 每支最少取样量 ：150mg 每支实际取样量：1g左右 （约为装量的2/5） 共计的接入量15克左右,十四烷酸异丙酯的用量约为供试品总接入量的1倍2倍左右。 作用：溶解膏剂中的凡士林，使红霉素分散均匀。 十四烷酸异丙酯实际用量25ml 萃取液：0.1%蛋白胨水溶液200ml 冲洗液：（检细菌、检真菌、阳性对照） 0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液2100ml （阴性对
5、照：冲洗液400ml）,小结： 薄膜过滤法： 阳性对照增加1/2最小检验量 检验数量： 15支，每支取样1克，总接入量15克 冲洗液用量：2100ml，（700ml/筒） 阳性对照金黄色葡萄球菌（100 cfu ） 供试品 阴性对照 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基,结果判断 规定温度，培养14天 供试品 a.无菌生长，同时阳性管有菌生长 符合规定 b.有菌生长 不符合规定 c.试验结果无效，须复试 设备环境原因 试验过程染菌 阴性管有菌生长 无菌操作不当 d.阳性管规定时间内无菌生长 （23天内 ） 须重新进行方法验证,7.方法学验证试验,当供试品为新的产品或供试品的组分、检验条件发生改
6、变时， 需进行方法学验证 直接接种法 （6个菌株） 考察供试品是否有抑菌作用 薄膜过滤法 （选择供试品对其生长有抑制作用的菌株做方法学考察）考察冲洗量以及其他灭活方法的效果,直接接种法 （方法学验证试验 ） 取红霉素眼膏一支，无菌操作取出全部内容物，移入含适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，作为供试液； 量取一定体积供试液（相当于固体取样量150mg）置相应的培养基中；(改良马丁） 接入相应的试验菌 （黑曲霉 or 白色念珠菌） 同时做阳性对照 25培养35天，逐日观察,结论1:,红霉素对黑曲霉生长无抑制作用. 红霉素对白色念珠菌生长无抑制作用.,薄膜过滤法考察冲洗量 （方法学验证试验 ） 试验菌
7、： (1)生孢梭菌64901 (2)铜绿假单胞菌10104 (3)枯草芽孢杆菌 63501 (4) 金黄色葡萄球菌26003 总取样量：15g / 每株试验菌,1,2,3,+:对照管; 1:没有冲洗; 2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积400ml. 35,培养24小时.,+:对照管; 1:没有冲洗; 2:冲洗液体积200ml. 35,培养48小时.,1,2,结论2:,红霉素对生孢梭菌生长无抑制作用. 红霉素对铜绿假单孢菌生长无抑制作用., :对照管; 1:没有冲洗; 2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积400ml. 35,培养72小时.,1,2,3,结论3:,红霉素对枯草芽孢杆菌有抑制作用. 每筒加样量5g(相当于红霉素25mg), 冲洗液体积400ml,枯草芽孢杆菌48小时后可见微弱生长,72小时生长良好. 3. 在该检验条件下,冲洗400ml,三天内可检出枯草芽孢杆菌.,+:对照管; 1:没有冲洗; 2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积400ml. 35,培养72小时.,1,2,3,500:冲洗液体积500ml; 700:冲洗液体积700ml. 35,培养72小时.,再验证试验,结论4:,红霉素对金黄色葡萄球菌有抑制作用. 在该检验条件下,冲洗700ml,残留的红霉素不影响金黄色葡萄球菌的生长.,