《8-实验诊断.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《8-实验诊断.ppt（118页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、临床病原体检测,芮勇宇 南方医科大学南方医院检验医学科,某年9月某日晚上某院急诊科来一病人，突然起病，寒战、剧烈头痛、恶心呕吐，面色潮红、眼结膜充血、咳嗽，左耳红肿热痛，体温40。,案例分析,医生及时抽血进行血液培养，血常规白细胞增高及核左移。 初步诊断败血症，收入院，使用泰能。 但是使用泰能3天，病人症状没有改善，血液培养阴性，给家属下病危通知书。,案例分析,请南方医院专家会诊，详细询问病史和仔细体查，得到重要线索，病人一周前爬过白云山，并躺在草地上休息；病人左耳有似被蚊虫叮咬后形成焦痂。,案例分析,怀疑恙虫病，外裴试验阳性。恙虫病立克次对头孢菌素类耐药，用四环素类抗生素，1天后退热，继续用
2、药1周，病人康复出院。 病原体检测重要性：明确临床诊断和指导临床用药。,案例分析,免疫室：酶链免疫吸附试验（ELISA）、胶体金层析试纸条、化学发光或电化学发光、乳胶凝集方法。 检测肝炎病毒、性病、呼吸系统病原体抗原或抗体。,检验科三个实验室合作进行病原体检查,基因室：荧光定量PCR方法，定量检测病原体基因。 细菌室（重点）：涂片检查、培养鉴定和药敏试验，检测细菌真菌。,检验科三个实验室合作进行病原体检查,第一部分 细菌真菌涂片检查及临床意义 第二部分 细菌真菌培养鉴定及临床意义 第三部分 细菌真菌药敏检测及临床意义 第四部分 临床各科科研工作结合本次课,Part 1 Morphologica
3、l examinations of bacteria and fungi,1 non-stained. 2 gram stain, bacteria and fungi. 3 acid-fast stain, acid-fast bacillus. 4 Indian ink stain, cryptococcus.,single-celled, budding forms called yeast (spore). multicellular, filamentous forms called mold (spore and hypha). dimorphic fungi, exist in
4、two distinct morphologic forms.,1 Non-stained,Skin scraping, nail scraping ,and observation of hairs directly by microscopy are also most helpful in diagnosing dermatophytic infections. Employing a drop of potassium hydroxide (15%) on a glass slide over the surface of the specimen.,hairs,Skin scrapi
5、ng,Routine urine examination,Basic principle？ Procedure？ Peptidoglycan. crystal violet, iodine, alcohol. carbofuchsin red. Results, G+ or G-, cocci or bacilli bacteria, fungi, in oil immersion field.,2 Gram-stained,fungi in urine,positive cultured blood,positive cultured blood,positive cultured bloo
6、d,positive cultured blood,positive cultured blood,positive cultured blood,sputum,sputum,sputum,sputum,sputum,Fungi in leukorrhea, vaginitis,Diplococcus Neisseria gonorrhoeae,Basic principle? Procedure? Lipid. carbolfuchsin red, hydrochloric acid 3% alcohol, methylene blue. Results, acid-fast bacteri
7、a red, other bacteria and background blue.,3 acid-fast stain,The result report mode Negative, acid-fast bacilli not found, Positive (1 or 2), 1 or 2 whole visual field, Positive （+）, 3 to 9 whole visual field, Positive （+）, 10 to 99 whole visual field, Positive （+）, 1 to 9 every visual field, Positi
8、ve （+）, 10 every visual field.,acid-fast bacilli from sputum（+）,Cryptococcus in cerebrospinal fluid. Basic principle, capsule. Procedure, sediment. Results.,4 the Indian ink stain,Cryptococcus neoformans,germinative,Advantages. cheap, rapid, diagnose primarily. Disadvantages. Not accurate.,Part 1 Mo
9、rphological examinations of bacteria and fungi,第二部分 细菌真菌培养鉴定及临床意义,一、血液 二、中段尿 三、粪便 四、痰液 五、咽拭子 六、穿刺液 七、分泌物 八、器械,一、血液的病原体检查 Etiologic Examination of Blood and Bone Marrow,目的和意义； 采血指征； 采血注意事项; 结果报告形式。,目前我国社会老龄化日趋严重，慢性病及恶性肿瘤、器官移植、爱滋病和结核病病人不断增多，侵袭性诊疗技术广泛应用，败血症发病率不断增加。 败血症病死率30%以上；早期病原学诊断和合理抗生素治疗，明显降低败血症病死
10、率。,血液培养的送检指征：,发热38或低温10109/L，“核左移”白细胞增多； 粒细胞减少，成熟的多核白细胞90次/分；呼吸频率20次/分； 二氧化碳分压32mmHg； 昏迷；多器官衰竭。,最好在抗生素使用前采集， 若已用抗菌药须，则尽量避开血药浓度的高峰期，最好在下次用药前。,血液标本采集时间,血液标本采集时间,理想状态：在发热高峰期前半小时， 建议第一次可在病人发热初期或高峰期采集， 根据病人发热情况，在24h内再取2-3次标本， 最好每次“双套”“双瓶”，“双套”指不同采血部位，“双瓶”指树脂瓶和厌氧瓶。,血液标本采集时间,标准血培养瓶（蓝色帽）： 帽子和标签纸左上方为蓝色， “Sta
11、ndard 10 Aerobic/F”， 用于成人需氧菌和真菌培养， 血液量3-10ml ，8-10ml最佳。,中和抗生素的树脂瓶（灰色帽）： 帽子和标签纸左上方为灰色， “PLUS+Aerobic/F” ， 血液量3-10ml ，8-10ml最佳。,厌氧瓶（黄色或橘红色帽）： 帽子和标签纸左上方为黄色， “Standard Anaerobic/F”， 血液量3-7ml ，5-7ml最佳。,中和抗生素的儿童瓶（粉红色帽）： 帽子和标签纸左上方为粉红色， “PEDS PLUS/F”, 血液量1-3ml。,采集标本前先开申请单，到检验科细菌室或门诊领取血培养瓶； 采血前先在培养瓶标签纸左侧空白处（
12、箭头所指处）填写抽血时间和病人科别、床号和姓名； 不要在培养瓶条形码上涂写，以免影响扫描。,将标签纸上条形码右侧部分（含数字）撕下贴于检查申请单上； 而其它标本均是将申请单上双联号码撕下贴于标本上。,注射器采血后，将血培养瓶帽子揭下，橡皮由金属皮（围脖）固定于瓶上； 将橡皮塞用70%酒精消毒，注射器针头刺穿橡皮塞将血注入培养瓶内； 橡皮塞裸露即可。,细菌室接到已采集血液的培养瓶后，立即放入自动血液培养检测仪，自动培养及实时检测。,阳性初步结果报告： 仪器阳性报警，90%以上阳性标本24h内检出； 取出阳性瓶，对血液涂片及革兰氏染色； 立即将涂片结果（G+、G-细菌，球菌或杆菌，或真菌）电话通知
13、相应科室，并在网上发出； 利用阳性血液进行K-B法药敏试验，第二天将初步药敏结果电话通知相应科室。,结果报告形式,阳性最终结果报告： 将阳性血液接种血平板培养细菌； 第二天将血平板上生长的细菌鉴定及MIC法药敏试验；第三天发鉴定及MIC法药敏结果的正式报告。 阴性结果报告： 如培养5天仍为阴性，再接种血平板培养一天，核实为阴性后再发报告。,结果报告形式,二、中段尿标本病原体检查 Etiologic Examination of Urine,目的和意义； 采集方法; 结果报告形式。,检测泌尿系统感染； 一般进行细菌和真菌培养、菌落计数和药敏； 也可离心后对沉渣进行涂片检查，革兰氏染色或抗酸染色；
14、 也可用于淋球菌培养和涂片检查。,目的和意义,最常采集中段尿，晨起第一次尿送检最佳； 先用肥皂水、或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗女性外阴部及尿道口或男性尿道口，再用灭菌水清洗，最后用灭菌纱布檫拭；排尿弃去前段尿，留取中段尿约10ml于无菌容器内加盖送检。,采集方法,尿道病原菌可在温暖尿液中繁殖，中段尿标本采集后应尽快送检，否则将影响病原菌计数的准确性； 排尿困难者可导尿，避免多次导尿所致尿路感染，导尿包必须为无菌的合格产品。,采集方法,“培养出3种以上细菌，疑采集污染，重留标本”： 如培养出3种或以上细菌，且无优势菌；约10%的标本不合格，采集时污染，采集中段尿（尤其女性）最好由专门医护人员
15、指导采集，以减少污染。,结果报告形式,“培养出少量某种细菌、菌落计数结果”： 如菌量较少 103ml，但为单一菌种，可能为采集时污染，也可能是真正的感染，临床医生可根据病人临床表现判断或再留取标本送检。,结果报告形式,“培养出某种细菌、菌落计数结果、药敏结果”： 一般认为细菌或真菌105ml ，且必须有优势，才可以确定为感染，对优势菌进行鉴定和药敏。 104ml至105ml，也有意义。,结果报告形式,三、粪便标本病原体检查 Etiologic Examination of Stool,目的和意义：对肠道疾病进行病原学诊断； 涂片染色：查真菌、弧菌、球菌/杆菌比； 培养病原菌和药敏： 培养沙门氏
16、和志贺菌；培养弧菌；培养真菌； 菌群失调病人，对占优势细菌进行鉴定药敏。,标本采集： 挑取含脓、血或粘液粪便约2-3g； 置于清洁容器或置于保存液中送检； 排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子采集。,检查上下呼吸道感染 痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）； 可进行涂片查细菌、真菌或抗酸杆菌； 可进行细菌、真菌或结核杆菌培养； 上述检查只要一口痰即可，在一张检查申请单上选上述多个项目。,四和五、呼吸道标本的病原体检查,采集深部痰（sputum），不是唾液和口水； 自然咳痰法(Expectorated sputum)； 最好为清晨第一口痰，用清水反复漱口用力咳出第一口痰于无菌容器内； 支气管镜采集法（B
17、ronchoscopy）。,采集方法,报“正常菌群”： 培养出的均为不致病的细菌； 培养出的细菌种类较多且无优势菌； 分离出少量嗜血杆菌,也报告鉴定及药敏。,结果报告形式,报“无菌生长”： 病人抗生素使用过度导致； 可能病毒、支原体、衣原体等血平板无法培养。,结果报告形式,报“分离出某种细菌或真菌，比例，药敏”： 分离出致病菌，而不是常见的正常菌群，且具有优势，约占血平板菌群总数的百分比%； 同一病人如痰中连续分离出同一种菌，3天内如果已经做过药敏试验，则不再做药敏； 同一病人痰中细菌的种类和比例，会随着治疗情况变化，也受留取痰标本的质量影响。,结果报告形式,六、穿刺液（脑脊液）病原体检查 E
18、tiologic Examination of Cerebrospinal Fluid,目的和意义：判断是否为感染性疾病 脑脊液采集：通过腰椎穿刺术（Lumber puncture）以无菌操作采集脑脊液3-5ml于无菌小瓶或无菌试管中，一般第一管用于微生物学检查；,六、穿刺液（脑脊液）病原体检查 Etiologic Examination of Cerebrospinal Fluid,引起脑膜炎的病原体脑膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集的脑脊液应立即保温送检或床边接种; 可查一般细菌真菌、隐球菌、抗酸杆菌。,其它穿刺液：如胸腹水、关节腔液等，穿刺针注入无菌拭子管送检或将注射器直接送检； 如
19、为多管穿刺液或相关组织，请在申请单上注明是否都做培养鉴定； 采集注意事项：注意无菌操作；如培养出类白喉杆菌，常为采集时污染所致；可用血液培养瓶培养。,七、分泌物（伤口或脓液）病原体检查,开放性化脓灶：应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸取脓性分泌物； 瘘管内脓液：先用灭菌棉拭子挤压瘘管弃去前端脓液，再收集脓汁；,七、分泌物（伤口或脓液）病原体检查,封闭性脓肿：可用注射器穿刺抽取； 疑为厌氧菌感染者：取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检； 如为液体，最好床旁接种厌氧血培养瓶； 外界相通部位的标本，如痰不能作厌氧菌培养。,七、分泌物（生殖道）病原体检查 Eti
20、ologic Examination of STDs,性传播疾病，简称性病，是一组通过性行为传播的，侵犯皮肤、性器官和全身多脏器损害的感染性疾病； 标本采集：常取生殖道分泌物，男性取尿道口分泌物或前列腺液，女性取外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物等。,淋病（gonorrhea） 涂片染色镜检： 急性淋菌性尿道炎敏感度和特异度高达90%以上；对慢性无症状淋病的女性患者涂片检查漏诊率达40%，故必须同时进行培养。 培养鉴定及药敏结果准确，诊断金标准。,解脲/人型支原体： 细菌室开展了培养鉴定及药敏方法； 需注意的是标本采集后应尽快送检。 诊断试剂和方法要符合卫生部相关规定； 注意保护病人的
21、隐私。,八、器械病原体检查 Etiologic Examination of other specimens,静脉插管等标本：放入无菌拭子管中送检； 无菌试验：怀疑医疗用品被污染时送检； 空气培养：到细菌室取培养平皿置于待测地点，打开平皿盖10min，盖上后送检； 医护人员手培养和物表培养：到细菌室取含消毒剂中和液的无菌试管，用棉签涂抹后放入试管中送检。,第三部分 细菌真菌药敏检测及临床意义,药敏结果检验报告的解读， 细菌分布及药敏结果分析。,药敏结果检验报告的解读,MIC稀释法（dilution method） K-B纸片扩散法（Kirby-Bauer method） E-test药敏检测,
22、常用药敏试验方法,K-B法是将含有定量抗菌药物的纸片，贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含药物吸收琼脂中水分溶解后，不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度。,K-B纸片扩散法药敏试验,K-B法药敏试验,不同的抗生素纸片,细菌接种于MH平板,量取直径,MIC稀释法一般在琼脂或肉汤中将抗菌药物系列对倍稀释，定量接种待检菌， 35培养18至24小时后观察结果； 抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即最小抑菌浓度； MIC稀释法结果以MIC（g/ml）数值报告，数值越小越敏感，与K-B法相反；,MIC稀释法药敏检测,稀释法的结果比K-B法的更准确。 本实验室利用细菌自动鉴定和药敏仪，为稀释法药敏试
23、验，由仪器自动判断药敏结果。,药敏检测的方法,BD Phoenix 100 细菌自动鉴定及药敏分析仪,E-test药敏检测,结合K-B法和稀释法的优点； 原理同稀释法检测，操作同K-B法简单； 试纸条上含干化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布的某种抗菌药物； 主要用于少数抗生素结果的验证。,E-test药敏检测,临床实验室标准化委员会（clinical laboratory standards of institute, CLSI）标准判断 敏感（susceptible，S）：推荐使用； 中介（intermediate，I）：药物MIC接近体液或组织可达到药物浓度，但反应低于敏感株； 耐药（r
24、esistant，R）；指常规用药剂量不能达到MIC，临床疗效不可靠。,药敏检测的方法,抗菌药物的作用靶位,氨基糖甙类：阿米卡星Amikacin、庆大霉素Gentamicin 1代头孢：头孢唑啉Cefazolin 2代头孢：头孢呋辛钠Cefuroxime sodium 3代头孢：头孢他啶Ceftazidime、头孢噻肟Cefotaxime、头孢吡肟（马斯平）Cefepime,细菌室药敏试验中常选用的抗生素种类,单环-内酰胺类：氨曲南Aztreonam 广谱青霉素类：氨苄西林Ampicilin、青霉素G Penicillin、苯唑西林Oxacillin 抗假单胞菌广谱青霉素：哌拉西林Pipera
25、cillin,复方-内酰胺类： 阿莫西林-克拉维酸（奥格门丁）Amoxicilin/clavelanate 氨苄西林-舒巴坦（优力新）Ampicillin/Sulbactam 哌拉西林-他唑巴坦（特治星）Pioeracillin/Tazobactam 头孢哌酮-舒巴坦（舒普深）efoperazone/Sulbactam 碳青霉烯类：亚胺培南Imipenem、美罗培南Meropenem,多肽类：多粘菌素E Colistin E、替考拉宁Teicoplanin、万古霉素Vancomicin 磺胺类：复方新诺明（甲氧苄唑-磺胺甲唑）Timethoprim/Sulfamethoxazole 林可霉素类
26、：克林霉素Clindamycin 大环内脂类：红霉素Erythromycin,氯霉素：氯霉素Chloramphenicol 三代喹诺酮：环丙沙星Ciprofloxaxin 、氧氟沙星Ofloxaxin 、左旋氧氟沙星Levofloxacin 、莫西沙星Moxifloxacin 四环素类：四环素Tetracycline 利福平Rifampin,产超广谱-内酰胺酶(extended spectrum-lactamase，ESBL)：该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类的超广谱-酶，主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生。,耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistance st
27、aphylococcus，MRS）， CLSI规定，葡萄球菌如对苯唑西林（或甲氧西林）耐药：对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均应报告耐药，而不考虑体外药敏结果。,耐高浓度庆大霉素肠球菌（High level aminoglycosides resistance in Enterococcus） CLSI规定，肠球菌引起的全身性严重感染，常联合应用-内酰胺类和氨基糖肽类抗生素，如果肠球菌对高浓度庆大霉素耐药，则联合用药无效。,细菌分布及药敏结果分析,不同类型标本分离细菌念珠菌构成比%,痰液中分离细菌念珠菌主要种类及构成比%,伤口分泌物中分离细菌念珠菌主要种类及构成比%,中
28、段尿中分离细菌念珠菌主要种类及构成比%,血液中分离细菌念珠菌主要种类及构成比%,大肠埃希菌耐药率%,肺炎克雷伯菌耐药率%,针对肠杆菌科细菌引起的严重感染， 碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南耐药率最低， 嗜麦芽窄食单胞菌对碳青霉烯类天然耐药，首选复方新诺明。,鲍曼不动杆菌耐药率%,铜绿假单胞菌耐药率%,针对鲍曼不动杆菌等非发酵G-杆菌引起的严重感染， 头孢哌酮-舒巴坦（舒普深）和碳青霉烯类抗生素耐药率最低。,金黄色葡萄球菌耐药率%,粪肠球菌耐药率%,针对葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属等G+球菌引起的严重感染， 糖肽类万古霉素、替考拉宁耐药率最低， 利奈唑胺耐药率也是最低，尤其用于治疗耐万古霉素肠球菌感染。,第四部分 结合本次课可开展的科研,各科室分离细菌真菌的种类及药敏特征； 各科室感染性疾病诊断及治疗效果评价； 各科室医院感染因素分析和防治措施研究。,Thank you!,