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1、第三节 DNA重组技术,第一个 DNA 重组子 （Paul Berg, 1972）,EcoRI recognition sites, phage DNA,EcoRI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,DNA重组的一般步骤,1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。,2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。,3.
2、 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。,4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。,重组DNA实验中常见的主要工具酶,基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。,一、载体,（二）类型,1、质粒载体 常用的克隆载体、双链环状的DNA分子（也有线性的）、能独立地自我复制及转录。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点: 分子量小，稳定存在，较高拷贝数； 遗传标志； 内切酶点。,（1）pBR322质粒载体,来源于pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（a
3、mpr）,来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tertr）,来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）,（2）pUC质粒载体,氨苄青霉素抗性基因(ampr)，,大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列,位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点(MCS)区段，它并不破坏该基因的功能。,来自pBR322质粒的复制起点（ori）,（3）pGEM-3Z质粒,2、噬菌体,（1）噬菌体的生物学特性 溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。(烈性噬菌
4、体只具有溶菌生长周期) 溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。(温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期),（2）噬菌体,A. 生物学特性 组成：蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。 DNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）。,温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。 复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制
5、 溶菌周期的早期是“”复制，晚期进行滚环复制 基因组成 DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约13为非必须区段。,B. 类型 插入型 （Insertion vectors ） 这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到10kb 置换型 （Replacement vectors） 这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。 如Charon 4 载体 克隆能力大，2025kb,（3）M13噬茵体,生物学特性 单链
6、闭合环状噬菌体 只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。,复制与增殖,进入细胞内部的M13（）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型 DNA。它按形式进行几轮复制之后，基因 的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA为模板合成 M13
7、（）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的 M13基因组DNA,3、柯斯质粒载体,柯斯质粒(cosmid)又称粘粒，是由DNA的cos区与质粒重新构建的载体，具有质粒相同的结构特点，为双链、环状DNA。“cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。因此我们说，所谓柯斯质粒其实是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。,柯斯质粒具有下列特点： 具有质粒载体的特性。 带有噬菌体的粘
8、性末端(cos区)。 一个或多个酶切位点。 具有高容量的克隆能力。 非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而有利于重组体的筛选。,4、病毒载体,组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜,常用的病毒载体的特点：,优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。,二、质粒DNA的提取,1、细菌的收获 含相应抗生素的液体培养基里培养 1.5ml离心管离心沉淀细胞,2、细菌的裂解 （1）碱裂解法 （2）煮沸法,（1）碱裂解法 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是
9、根据Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修订而成。 优点：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。 基本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。,十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。,纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两
10、个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。,三、质粒DNA的纯化,氯化铯密度梯度离心法,实验表明，在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。这种差别对质粒DNA的纯化是十分有用的。,缺点
11、,通过氯化铯-EtBr密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量的质粒DNA，但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会危及实验工作人员的身心健康。,根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。 类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。 类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。 故类和类酶在基因工程中基本不用。,1、限制
12、酶的类型,四、DNA酶切,型酶,型酶就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,（一） DNA的连接 1、DNA连接酶 T4 DNA连接酶（需要ATP作为辅助因子）主要用于：（1）连接具有同源互补粘性末端的片段；（2）双链DNA分子间的平端；（3）在双链平端的DNA分子
13、上添加合成的人工接头或适配子。 2、粘性末端连接 连接后可能出现以下问题：（1）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA 5- 端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；（2）插入片段可双向插入；（3）插入片段可多拷贝插入。,五、DNA的连接和转化,3、平端连接 平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端，这对不同DNA分子的连接十分有利。 平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4 DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（）可促进平端连接反应。 4、人工接头连接 5、利用适配子连接,（二）重组DNA的转化 1、
14、转化 指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。 此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。,（1）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。,步骤：,（2）与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。,（3）立即将该体系转移到42下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。,（5）涂布于选择性培养基中分离转化子。,（4）在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复
15、,2、转染和感染 感染：在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。 转染：在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。,（一）抗药性标志的筛选 （二）半乳糖苷酶系统筛选 （三）菌落快速裂解鉴定法 （四）内切酶图谱鉴定 （五）通过聚合酶链反应筛选重组子 （六）菌落或噬菌斑原位杂交,六、重组质粒的筛选和鉴定,第四节 分子杂交技术,杂交(hybridization) ：来源不同的两条彼此的链重新缔合成为双螺旋结构的过程。（注意与复性的区别）,在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DN
16、A或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。,分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一。利用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特点、基因结构和定位、基因表达等。,电泳凝胶核酸印迹法、,斑点和狭线印迹法、,菌落和噬菌斑印迹法,E.M. Southern于1975年首先设计出来的。,材料： 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜 二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）,步骤：,第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移,第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA探针进行
17、杂交,一、Southern印迹杂交,Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测,二、Northern印迹杂交,是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。,三、斑点杂交,Step 1. Antibody Recognition of target protein/antigen,Step 2. Secondary Antibody recognition of primary Ab,Step
18、 3. Color Development,四、Western印迹杂交,五、原位杂交（教材P175）,组织原位杂交简称原位杂交（in situ hybridization），是在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与RNA或DNA杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。,基本步骤是通过适当处理使细胞渗透性增加，探针进入细胞内与DNA或RNA杂交、冲洗等。用放射自显影或免疫酶法或荧光显示杂交结果。,Localization of DNA,Localization of RNA,六、基因芯片,基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标
19、记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。,(教材p.214-218),（一）基因芯片的种类,1、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列,2、微电子芯片,3、微量点样技术,4、其他技术,（二）应用领域,1、科研领域,2、生物制药领域,3、医学诊断,七、酵母杂交技术,（一）酵母双杂交技术,1、基本原理,2、改进和发展,(教材p.206-208),（二）酵母单杂交技术,1、酵母单杂交技术的原理,2、酵母单杂交技术的应用,第五节、基因扩增与定点突变技术,一、聚合酶链式反应（PCR）,(教材p.165-170),（一）PCR反应中的主要成份,1、DNA模板,2、dNTPs,3
20、、引物,4、Mg+,6、反应缓冲液,5、DNA聚合酶,引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： 长度约为16-30bp; G+C含量通常为40%-60%; 四种碱基应随机分布; 3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位 核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对; 在引物内, 尤其在3端应不存在二级结构; 两引物之间尤其在3端不能互补; 5端可增加酶切位点; 引物不与模板结合位点以外的序列互补; 简并引物应选用简并程度低的密码子。,Target Sequence,（二）PCR反应参数,1、变性,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1
21、,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,2、退火,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,3、延伸,Target Sequence,Target Sequence,4、循环次数,片段扩增倍数,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4
22、 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,（三）PCR产物的克隆,平末端连接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3端加上多余的非模板依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。 2. 在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。 3. 粘性末端连接：利用引物中附加在5端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA。,二、RT-PCR,反转录PCR 1、利用mRNA作模板，在反转录酶的作用下，合成cDNA。 2、以cDNA为模板，进行PCR扩增反应。,反转录酶,S1核酸酶,碱,Klenow+dNTPs+缓冲液,双链cDNA,三、定点突变（site-directed mutagenesis）,1、盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。,(教材p.197-200),2、寡核苷酸引物诱变,3、PCRG与PCR诱变,