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1、实验一 蛋白质和氨基酸的 呈色反应,一、实验目的,1、了解蛋白质和氨基酸的呈色反应原理 2、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方 法。 3、了解呈色反应在定性和定量分析中的应用。,（一）双缩脲反应 1、原理 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。,2、试剂 （1）尿素 （2）10%氢氧化钠溶液 （3）1%硫酸铜溶液 （4）2%卵清蛋白溶液 3、操作 （1） 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化，尿素放出氨 。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观
2、察出现的粉红颜色。添加要避免过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 （2）向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。,剂i,（二）茚三酮反应,2、试剂 （1）蛋白质溶液 （新鲜蛋清：水=1:9) 100ml （2）0.5%甘氨酸溶液 （3）0.1%茚三酮水溶液 （4）0.1%茚三酮-乙醇溶液 3、操作 （1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝。 （2）在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干
3、后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。,剂i,剂i,（三）黄色反应 1、原理,2、试剂 （1）鸡蛋清溶液 （2）头发 （3）指甲 （4）0.5%苯酚溶液 （5）浓硝酸 （6）0.3%色氨酸溶液 （7）0.3%酪氨酸溶液 （8）10%氢氧化钠溶液 3、操作 向6个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。,剂i,剂i,（四）乙醛酸反应 1、原理,紫红色,剂i,2、试剂： (1) 蛋白质溶液 鸡蛋清：水1：20 (2）冰醋酸 (3) 浓硫酸(
4、分析纯) 3、操作 向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸约1ml,倾斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(AR)约1ml，使其重叠，勿使两者混合。静置后，观察在两液界面上出现的红紫色环，于水浴中微热，可帮助颜色形成。 用20%白明胶作乙醛酸反应。白明胶分子中无色氨酸，所以不呈此反应。,剂i,(五)考马斯亮蓝反应 1、原理 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。 它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.011.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 2、试剂 （1）蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20） 5 ml （2）考马斯亮蓝染液 300 ml 考马斯亮蓝G250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加100 ml 85%磷酸混匀，配成原液。临用前取原液15 ml，加蒸馏水至100 ml，用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01%。,剂i,3、操作 取2支试管，按下表操作,