核酸210秋.ppt

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1、（四）真核细胞染色体DNA结构,真核细胞染色体DNA的基本结构单位是核小体。 核小体是由DNA和组蛋白组成的。,6个核小体念珠绕成30nm纤丝（fiber),纤丝扭曲变成突环（loop)，约75000bp,六个突环一个玫瑰花结（rosette)。 进而组装成螺旋圈(coil)，由螺旋圈 再组装成染色单体（chromatid)。,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA （2nm）,核小体链（ 11nm，每个核小体200bp）,纤丝（ 30nm，每圈6个核小体）,突环（ 150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（ 300nm ，6个突环）,螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花）

2、,染色体（ 1400nm， 每个染色体含10个玫瑰花200bp）,真核生物DNA的序列特点,1.重复序列 1)高度重复序列 2-百个bp/copy, 105-106 copies/genome 多为串联重复排列 分布于着丝点、端粒区、结构基因两侧 2)中度重复 小于1Kb/copy 10-105copies/genome 多为间隔重复 rDNAtDNAHistone gene cluster 3)单拷贝序列（single copy sequence) 单一序列（unique sequence）,2回文结构（palindromic structure）,(1) 回文结构,回文结构也称反向重复（i

3、nverted repeats）,发夹形和十字形,单链,双链,较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。转录的终止作用与回文结构有关。,（一）RNA的类别,1核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）,2转移RNA（transfer RNA, tRNA）,3信使RNA（messenger RNA, mRNA）,五、RNA的结构,4其它类别的RNA,1.由A,U,G,C四种碱基组成。 2.含有较多的稀有碱基。 3.大部分的RNA中,AU;GC。 4.mRNA的碱基组成与DNA非常相似(U代替T),有人称D-RNA。,（二）RNA的碱基组成,（三）RNA的一级结

4、构,1连接键,3,5-磷酸二酯键,天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。,2. RNA的一级结构特点,3RNA分子中核苷酸的排列顺序,酵母tRNAAla,小片段重叠法,化学裂解法（直读法）,1965年,cDNA法,四几类RNA的一级结构,（2）rRNA的一级结构,原核生物 核糖体,70S,50S,30S,5S rRNA， 23S rRNA,34种蛋白质,16S rRNA,21种蛋白质,真核生物 核糖体,80S,60S,40S,5S rRNA，5.8S rRNA，28S rRNA,49种蛋白质,18S rRNA,33种蛋白质,原核细胞mRNA的结构特点,（3）mRNA的

5、一级结构,真核生物mRNA的一级结构:,顺反子（cistron）,5-cap,cap0: m7G(5)pppNp,cap1: m7G(5)pppNmpNp,cap2: m7G(5)pppNmpNmpNp,5-帽子：m7G 5 -ppp5-Nm（ Nm ）p- m表示甲基化,核糖未甲基化,一个核苷酸甲基化,二个核苷酸甲基化,m7G-5ppp-5Nm p,5,5,独特的5- 5连接,5-cap的功能,(1) 防止mRNA被核酸酶降解。,(2) 为mRNA翻译活性所必需。,(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。,3-polyA : polyA的残基数20200个，或更多。,polyA的功能,(1) 保

6、护mRNA，免受核酸外切酶的作用。,(2) 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。,(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。,（三）RNA的二级结构,大多数天然RNA是一条单链，通过自身回折形成部分螺旋区，部分非螺旋区。,RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆积力，其次是氢键。,一、tRNA 的二级结构,特征： 单链 三叶草叶形 四臂四环,氨基酸接受臂,二氢尿嘧啶臂,反密码 子臂,反密码子环,TC臂,TC环,额外环,二氢尿嘧啶环,1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。,近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。,例外

7、：,2rRNA的二级结构,（四）RNA的三级结构,tRNA的三级结构 -倒L型,X光晶体衍射解出的 tRNA 立体结构,（一）一般性质：,分子大小：DNA Mr 106109或更大,性状： DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。,溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂（比如乙醇），微溶于水,但它们的钠盐在水中溶解度较大。,RNA Mr 104106或更大,七、核酸的性质和最常用的研究方法,（二）粘度:可作为DNA变性(粘度降低)的指标,（三）酸碱性质及等电点,DNA的pI约为45， RNA的pI约为2.02.5， 在pH78电泳时泳向正极。,（四）紫外吸收,由于核酸中碱基的共轭双键

8、，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。,天然DNA 变性DNA 单核苷酸总吸收值,DNA的紫外吸收光谱,紫外分光光度法应用,1. 判断纯度,纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0,2.计算含量,若260nm光吸收值为 1 相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,或相当于20g/ml寡核苷酸。,3.判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，紫外吸收及摩尔消光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，紫外吸收及摩尔消光系数减小（减色效应）,增色效应（hyperchromic eff

9、ect）,减色效应（hypochromic effect）,注意定义：,（五）沉降特性,1核酸浮力密度的测定,浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度,2核酸的构象和分离关系,：RNA环状DNA线状DNA蛋白质,超螺旋DNA或,（六）核酸的变性、复性,1变性（denaturation）,在物理、化学因素影响下， DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，伴有A260增加, DNA的功能丧失的过程。,引起核酸变性的因素:,1).外因: A热变性； B酸碱变性（pH小于4或大于11）； C有机试剂变性（尿素、盐酸胍、甲醛）等。 2).内因: A.碱基的含量 (AT易变性,GC不易)； B.DNA的均一

10、性； C.碱基的顺序效应。,2 熔点（Tm）,定义：通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度，用Tm表示。,3 影响Tm值的因素, DNA的均一性 ：均一性高，变性温度范围越窄, DNA中G-C对的含量： 核酸 G+C 组成越高者 Tm 越大,经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44, 盐离子强度：离子强度高，Tm高。,4 复性（renaturation）,指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。,（1）复性,

11、理化性质: 比旋光度 粘度,生物活性得到全部或部分恢复,（2）影响复性的因素,1 DNA的浓度( 浓度大 易复性),2 DNA片段的大小( 片断小 易复性),3 温度 ( 低于Tm 25度 易复性),4 重复序列（具有多重复序列DNA，复性快）,（3）复性动力学一定条件下，复性的反应速度用Cot来表示,Co-为变性DNA原始浓度 molL-1 t -为时间，以秒表示。,Cot :,时的Cot值，即指复性完成一半时的Cot值。,（七）凝胶电泳,核酸研究中最常用的方法,优点：简单、快速、灵敏、成本低。,通过凝胶电泳,（1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。,（2）测定分子大小。,（3）估计核酸的构象

12、。,凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应,1琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis） 超螺旋最快，环型其次，线型最慢,2聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis）,琼脂糖凝胶电泳在紫外光下显色,M：DNA（ Hand+EcoRI）双切 Marker Lane 1：质粒对照，目的片段为1.28kb Lane 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16：GUS阳性植株，扩出约1.3 Kb的带。 Lane 11：未转基因植株对照。,GUS阳性苗的PCR扩增,（八）杂交（hybridization）,

13、（DNA-DNA） （DNA-RNA） （RNA-RNA）,利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。,不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时， 只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补 配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间， 即形成所谓的杂化双链，这个过程称为杂交,Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。 研究对象是mRNA，探针一般是DNA,Western 印迹（ Western blotting）抗原与抗体的杂交,1975年英国E

14、. M. Southern首创的Southern blotting -（Southern印迹）,八、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备,（一）核酸的分离、提取通则,为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 :,1保持低温（04）。,2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。,3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂； 或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）； 或加蛋白变性剂。,抑制RNase：,（1）玻璃器皿：140-200 C，8小时； 塑料器皿：0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）37 C ，过夜,（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸

15、胍、异硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等特异的 Rnase 的抑制剂。,（二）大分子DNA的提取,1材料的选择,2细胞破碎,3去蛋白质,（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1,4沉淀DNA:水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。,5去杂质,（1）去RNA,（2）去多糖,6进一步纯化,*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纤维状DNA,较纯DNA,纯DNA,破细胞,1.0mol/L NaCl*,去蛋白质,酒精沉淀,去RNA,柱层析，电泳,密度梯度离心,去

16、多糖,DNA,（三）RNA的提取,实验室RNA的提取,（1）酚提取,（2）酚-氯仿-SDS法,工业上制备RNA,（1）稀碱法,（2）浓盐法,（四）核酸纯度鉴定,1.A260/A280,2.电泳,（五）核酸含量的测定,1.定磷法,2.定糖法,3.紫外吸收法,本章重点及难点 重点：掌握核酸构件分子的结构特点、代号；掌握DNA二级结构特点、稳定力、三级结构特点及有关概念；掌握RNA二级结构特点、类型；了解核酸的重要理化性质。 难点：构件分子的结构特点，DNA二级结构要点及三级结构有关概念，tRNA二级结构特点、真核生物mRNA二级结构特点，核酸理化性质中涉及的概念及应用。,1、热变性的DNA分子在适

17、当条件下可以复性，条件之一是（ ） A、骤然冷却 B、缓慢冷却 C、浓缩 D、加入浓的无机盐 2、tRNA的分子结构特征是： （ ） A、有反密码环和 3端有CCA序列 B、有密码环 C、有反密码环和5端有CCA序列 D、5端有CCA序列 3、下列关于DNA分子中碱基组成的定量关系哪个是不正确的？（ ） A、C+A=G+T B、C=G C、A=T D、C+G=A+T 4、具5CpGpGpTpAp-3顺序的单链DNA能与下列哪种RNA杂交? （ ） A、5-GpCpCpAp-3 B、5-GpCpCpApUp-3 C、5-UpApCpCpGp-3 D、5-TpApCpCpGp-3 5、下列关于mR

18、NA描述哪项是错误的？ （ ） A、原核细胞的mRNA在翻译开始前需加“PolyA”尾巴 B、真核细胞mRNA在 3端有特殊的“尾巴”结构 C、真核细胞mRNA在5端有特殊的“帽子”结构,6、Tm是指( )的温度 A、双螺旋DNA达到完全变性时 B、双螺旋DNA开始变性时 C、双螺旋DNA结构失去1/2时 D、双螺旋结构失去1/4时 7、稀有核苷酸碱基主要见于( ) A、DNA B、mRNA C、tRNA D、rRNA 8、双链DNA的解链温度的增加，提示其中含量高的是（ ） A、A和G B、C和T C、A和T D、C和G 9、某双链DNA纯样品含15的A，该样品中G的含量为（ ） A、35

19、B、15 C、30 D、20,1、杂交双链是指DNA双链分开后两股单链的重新结合。（ ） 2、tRNA的二级结构是倒L型。（ ） 3、DNA分子中的G和C的含量愈高，其熔点（Tm）值愈大。（ ） 4、如果DNA一条链的碱基顺序是CTGGAC，则互补链的碱基序列为GACCTG。（ ） 5、在tRNA分子中，除四种基本碱基（A、G、C、U）外，还含有稀有碱基。（ ） 6、一种生物所有体细胞的DNA，其碱基组成均是相同的，这个碱基组成可作为该类生物种的特征。（ ） 7、核酸探针是指带有标记的一段核酸单链。（ ） 8、DNA是遗传物质，而RNA则不是。（ ）,1、DNA和RNA的结构和功能在化学组成、分子结构、细胞内分布和生理功能上的主要区别是什么？ 2、从两种不同细菌提取得DNA样品，其腺嘌呤核苷酸分别占其碱基总数的32%和17%，计算这两种不同来源DNA四种核苷酸的相对百分组成。两种细菌中哪一种是从温泉（64）中分离出来的？为什么？ 3、计算（1）分子量为30900的双股DNA分子的长度；（2）这种DNA一分子占有的体积；（3）这种DNA一分子占有的螺旋圈数。（一个互补的脱氧核苷酸残基对的平均分子量为618） 4、谈谈你所知道的核酸研究进展情况及其对生命科学发展的影响 。,