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1、二、动物细胞融合与单克隆抗体,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,人工条件下，如何促成动物体细胞的融合？,（一）动物细胞融合,细胞融合诱导剂： 灭活的病毒、 （其它物理化学手段同植物体细胞杂交）,应用： 主要用于制备单克隆抗体,灭活病毒诱导细胞融合的原理：,病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏这些病原体的抗原结构。,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,主要用途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离
2、心、振动、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,细胞膜的流动性,细胞融合的原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较,如果患者想知道自己是否得了乙型肝炎，一般是先检查血液里是否有病毒的蛋白质，也就是病毒的抗原等,2,血清中的抗体,有时患者体内无乙肝病毒，但是用血清抗体进行检验时，会出现相应的免疫反应（即假阳性）。,如何得到单一的抗体A或B？,人们获得抗体的传统方法是什么？,细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术,细胞融合 将两个或多个细胞结合形成一个细胞（杂交细胞）。,细胞重组 把不同细胞的部件重新组装，包括核移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。 杂交瘤技
3、术 通过细胞融合产生特异杂交瘤细胞，用于生产单克隆抗体。,单克隆抗体制备的原理及流程,（二）单克隆抗体,1）注射特定抗原,4）筛选杂交瘤细胞,3）杂交瘤细胞特点,1 制备过程：,5）细胞培养（克隆）,6）提取单克隆抗体,2 单克隆抗体的优点：,特异性强、灵敏度高,2）效应B细胞+骨髓瘤细胞杂交瘤细胞,1）作为体外诊断试剂,3 应用,结合药物的单克隆抗体,2）运载药物 如制备生物导弹,鼠源性的,嵌合的,用于治疗是很受限制的。原因是：,人源性的,对鼠源化抗体进行改造-蛋白质工程,直接生产人源化抗体-基因工程,Monoclonal Antibodies,Khler 和 Milstein 75年建立的
4、技术，通过杂交瘤技术获得的针对单一抗原决定簇的高特异性抗体。,1。细胞融合 （1）动物与抗原免疫：加强免疫 （2）骨髓瘤细胞：体外无限繁殖并不分泌抗体；HGPRT基因缺失，经8-氮鸟嘌呤培养基筛选；对数期 （3）免疫B细胞悬液制备：挤压脾脏 （4）饲养细胞：细胞生长需要一定密度；融合细胞大量死亡需要清除；加入同种活细胞（饲养细胞）小鼠腹腔细胞（巨噬细胞；分泌促细胞生长因子和“清道夫”）；脾脏细胞和成纤维细胞 （5）细胞融合：早期用仙台病毒，现在用PEG，使细胞膜上脂质结构重新排列；瘤细胞：B细胞=1：5；加瘤细胞和B细胞对照 （6）基础培养系统：胎牛血清；无牛抗体；加抗生素,2。选择性培养 （
5、1）HAT培养液：细胞合成DNA有两条途径：一为主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸，氨基碟呤可阻断；二为补救途径，通过磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。所以骨髓瘤细胞缺乏HGPRT和TK，死亡；B细胞具有HGPRT，但在体外不能长期培养，自然死亡；只有杂交瘤细胞从B细胞获得HGPRT或TK基因在HAT培养基上生长繁殖。 （2）阳性克隆筛选：用酶联免疫吸附试验（ELISA）检验特异性抗体 （3）克隆化培养：1个细胞/孔 3。McAb扩大生产： （1）腹腔积液型（2）细胞生物反应器 4。 McAb鉴定与纯化（1）单克隆抗体的鉴定（2）纯化：
6、辛酸或硫酸铵盐析；二抗采用蛋白A或蛋白G层析,Monoclonal antibodies: 均一；纯度、效价高； 特异性强,细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。 淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能在体外无限增殖；骨髓瘤细胞中只有D途径，可以在体外无限增殖。 将这两种细胞在试管中混合，可以获得两两融合的细胞。 如何从融合的细胞中分离出杂交瘤细胞？,HAT培养基 筛选杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞在细胞培养板上培养。测定时，加入相应的抗原等物质，检测各孔的上清液中细胞分泌的抗体，产生有色反应的为阳性。,酶联免疫吸附试验 筛选特定的杂交瘤细胞,2,将杂交瘤细胞（细胞表面携带抗体）固定于微孔板上。测定时，加入抗原、酶标抗体，清洗游离的成分之后，加入酶促反应底物，产生有色反应即为阳性。,酶联免疫吸附试验 筛选特定的杂交瘤细胞,2,有限稀释法 分离单一的杂交瘤细胞,阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,