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1、第五章 扫描电镜生物样 品制备技术 第一节第一节 常规常规生物样品生物样品SEMSEM 制备技术制备技术 Features of SEM 高分辨率高分辨率 Features of SEM 强立体感强立体感 Features of SEM 广泛的放大倍率广泛的放大倍率 Features of SEM 应用范围广应用范围广 生物、医学、动物、材料、 化学 、物理、地质、冶金、矿物、污 泥 (杆菌)、机械、电机及导电性 样品如半导体电子材料等 材料学土聚水泥 制备扫描电镜样品的总要求 在不损伤样品原始结构状态 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 表面的微细结构 。 生物样品的
2、特性 含水量高 质地柔软 导电性差 二次电子产率低 对热、电子束等敏感 扫描电镜生物样品要求： 不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌 扫描电镜样品常规制备的操作程序扫描电镜样品常规制备的操作程序 1. 取 材 2. 清 洗 3. 固 定 4. 脱 水 5. 干 燥（置换） 6. 粘 托 7. 镀 膜（导电处理） 一、 取取 材材 要 点： 确定观察样品的目标 要求及注意事项： 做好充分准备（试剂、仪器、器械等） 保护观察面，作好标记 速度要快 ，每次取材数量不宜过多 大小要合适 10 10 5毫米 避免拉割、挤压 二、清洗清洗 目的：去除观察面的杂
3、质，充分暴露观察面 方法：物理方法: 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 化学方法: 用酶消化法 注意事项： 在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型 清洗液的选择 n一般组织：等渗生理盐水 n游离组织细胞：缓冲液、等张液 n表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜） ：低浓度蛋白水解酶 n组织培养细胞：组织培养液 n特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质 ，选用去垢剂Triton X-100） 三、 固定 目的： 保存样品表面的真实结构； 硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品 的损伤； 提高样品的二次电子发射率； 提
4、高样品的耐热性和导电性。 常用的固定剂： 2.5%戊二醛 （13h) 1.0%四氧化锇(301h) 固定温度： 室 温，一般以4为宜。 四、脱水 要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。 常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水 时间：视样品大小而定 注意事项：避免裸露，夹伤 五、干燥干燥 目的：去除样品中的脱水剂 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 叔丁醇干燥法、临界点干燥法等 常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法 空气干燥法 n方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度 ，退回至85%脱水剂，取出，空气中自然 干燥。 n优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程 中减少了样品的收
5、缩及损伤 n缺点：常常使样品发生变形收缩 n适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫 等含水量较少的样品 冷冻干燥法 n方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液 氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真 空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂 直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。 n优点：不存在气相与液相间的表面张力问题 ，故对样品损伤较小。 n缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤 ，费时。 n适用范围：含水量较多的生物样品 叔丁醇干燥法叔丁醇干燥法 （1）乙醇梯度脱水至100 / 2次 （2） 叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇 70 、 80 、 90 、95 和 100 / 2次 5
6、- 10min/次 （3）在样品表面滴上 100%叔丁醇 （4）将标本置于4以下使样品快速固化 （5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。 临界点干燥法 原理：利用物质在临界状态时，气相与液相 的界面消失，样品在没有表面张力的 情况下进行干燥。 步骤：脱水 置换（醋酸异戊酯） 预冷 放入样品 注入液态CO2 CO2置换 CO2加温气化 排除CO2 温度：31.4度 压力：73个大气压 临界点干燥法 空气干燥法 Comparison between critical point drying and air drying 六、粘托 SEM样品在干燥处理 或金属镀膜之前，需用特 制导电胶或双面胶将
7、样品 粘贴在金属样品台上。 导电胶一般具有黏着 力较强、容易挥发固化、 干燥后表面电阻率低、导 电性能好等特点。 要点：稳，钝角 样 品 粘 托 Fixing the specimen 七、镀膜（样品的导电处理） 目的：使样品导电，增加二次电子的发射率 金属镀膜技术：包括真空喷镀法和离子溅射法 真空喷镀法 方法：在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金属膜。 缺点：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成“死角”。 离子溅射法 原理： 利用气体在低真空中的辉光放电所产生的 高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金 属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。 在到达样品前，金属粒子
8、之间以及金属粒子与 气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒 子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以在 样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属 膜。 离子溅射的优点： 要求的真空低 工作温度低 金属粒子无方向 连续的、厚度均匀 甲 虫 3kV 大肠杆菌 耳蜗 尿酸钠结晶 红细胞 巨噬细胞吞噬 上左：兔肾小体细胞 上右：血细胞发生 下图：十二指肠绒毛 SEMSEM觀察苗木下表皮氣孔分觀察苗木下表皮氣孔分 佈及葉部組織之微細構造佈及葉部組織之微細構造 A A：氣孔密度：氣孔密度( (橫線橫線=120mm)=120mm) B B：氣孔形：氣孔形態態( (橫線橫線=12mm)=12mm) C C：
9、葉組織：葉組織( (橫線橫線=120mm) =120mm) A A B B C C SEMSEM觀察泡桐根瘤線蟲微細構造觀察泡桐根瘤線蟲微細構造 SEMSEM觀察觀察A. A. scrobiculatascrobiculata 孢子之外觀形態孢子之外觀形態 ( (橫線橫線=60mm)=60mm) SEMSEM觀察觀察G. G. mosseaemosseae 丛枝菌根真菌丛枝菌根真菌 孢子之外觀形態孢子之外觀形態 ( (橫線橫線=100mm) =100mm) 接種菌根菌及接種菌根菌及2%2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造 (A(A：橫線：橫線=30mm=30mm
10、；B B：橫線：橫線=12mm)=12mm) 未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造 (A (A：橫線：橫線=300mm=300mm；B B：橫線：橫線=12mm)=12mm) T R R T T. harzianum (T)寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形 松材線蟲頭部口針松材線蟲頭部口針 松材線蟲松材線蟲( (雄雄) )松材線蟲松材線蟲( (雌雌) ) 白粉病分生孢子白粉病分生孢子 麻竹墊銹菌孢子麻竹墊銹菌孢子 第二节第二节 扫描电镜特殊样品制备技术扫描电镜特殊样品制备技术 特殊生物样品制备主要有： （1）管道铸型样品 （2）冷冻断裂样品 （3）游离细胞
11、样品 （4）组织消化样品 1. 管道铸型样品 用于研究血管淋巴管胆管等空腔性脏器 的立体结构关系和内表面结构。 铸型方法: 铸型剂灌入管腔 硬化成型后将 组织腐蚀去掉 处理铸型进行观察 铸型处理：干燥 喷镀 观察 2 冷冻断裂样品 用于实质性脏器内部组织结构的研究，观 察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间 的关系。 步骤：取材 固定 清洗 防冻 冷冻 包埋 割断 软化 后固定 导电 及终末固定 脱水 临界点干燥 镀膜 观察 要求：取材迅速 ，大小为1 1 5mm， 用具要 预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要 快，外力要轻 3 游离细胞样品 样品制备要点： 将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、 固定 步骤：预固定 离心 涂片 固定 脱水 干燥 镀膜 血细胞 4 组织消化样品 用化学腐蚀或酶消化方法，来充分 暴露和显示被检样品结构的表面形态。 步骤： 固定 清洗 消化 表面稳定 后固定 脱水 干燥 镀膜 观察 谢 谢！谢 谢！