1、TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与 其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时 分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同 时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机 相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA; 用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品(50100mg组织、5x106细胞)也适用于大量样品(1g 组织、 107细胞)。对人,动物,植物组
2、织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整 个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时 如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNase I处理RNA样品,避 免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和 酶切。蛋白质可用于 Western Blotting。规格:100ml黄色透明液体储存条件:28C避光保存12个月 注意:请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量
3、水冲洗。 忌用乙醇擦洗,乙醇会加重灼伤程度。预防 RNase 污染注意事项:1经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。2使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4小时,塑料制品可在0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除 RNase。4配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC 至终浓度0.01%v/v,放置过夜,高压灭菌注:DEPC有致癌之嫌,需小
4、心操作)。RNA 的提取准备试剂:氯仿,异丙醇,75%乙醇,无RNase的水或0.5%SDS (溶液均需用DEPC 处理过的水配制)。操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆 处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直 径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于 细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。C.细胞悬液离心收集细胞,每510x106动物、植物、酵母
5、细胞或1x107细菌细胞加入 ImlTRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细 胞需用匀浆仪处理。2将匀浆样品在室温(1530C)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。3. 可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部 分等)可于28C10000xg离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多 糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清 的匀浆液进行下一步操作。4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。5. 2-8C10000xg
6、 离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相 和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。6. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。 用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。7. 28C10000xg离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现 胶状沉淀。移去上清。8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。28C不超 过 7500xg 离心 5 分钟,弃上清。9室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约
7、晾510分钟即可不要真空离心干燥, 过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25200pl无RNase的水或0.5%SDS,用 枪头吸打几次,5560C放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS 溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解,-70C保存。注意事项:1从少量样品(110mg组织或102104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促 进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加510pgRNase-free糖原。 糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响 PCR 反应。2匀浆后加氯仿之前样品可以在
8、60至-70C保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中28C星期以上或-5至-20C年以上。3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600xg离心3060分钟。预期产量:1mg组织或1x106细胞提取RNA分别为:肝和脾610pg,肾34pg,骨骼肌和脑组织11.5pg,胎盘14pg,上皮细 胞815pg,成纤维细胞57pg。常见问题分析:得率低:A. 样品裂解或匀浆处理不彻底。B. RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65 :A. 检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了 TE中。低离子浓度和低pH值条件 下 A280 值偏高。B. 样品匀浆时加的试剂量太少。C.
9、 匀浆样品时未在室温放置5分钟。D. 吸取水相时混入了有机相。E. RNA沉淀未完全溶解。RNA降解:A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 待提取RNA的样品没有保存于-60 至-70C,而保存在了-5至-20C。C. 细胞在用胰酶处理时过度。D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了 3.5。DNA污染:A. 样品匀浆时加的试剂量太少。B. 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液。蛋白聚糖和多糖污染:沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相 中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(
10、0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCI)混合离心,按之前 操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多 糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。DNA的分离准备试剂:乙醇0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)75%乙醇8mM NaOH操作步骤:1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用 ImITRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,28C不超过2000xg离心5分钟。2. 移去上清,(如需分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含 10%乙醇的 0.1M 柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用ImITRIzol
11、加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,28C 2000xg 离心5 分钟,弃上清,重复一次。3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1ml TRIzol加入1.52 ml75%乙醇,室温放 置 1020 分钟(不时颠倒混合) 28C2000xg 离心5 分钟, 弃上清。4. 室温放置晾干DNA 515分钟,用8mM NaOH溶解DNA。从5070mg组织或 107细胞中分离的DNA溶于300600pl 8mM NaOH, DNA的浓度通常为0.20.3pg/pl。 提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9, 溶解DNA后可用TE,HEPES调节
12、pH。从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能 包含一些胶状不溶物可12000xg离心10分钟除去。DNA的定量:取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当 于50pg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数,人、大鼠、小鼠1x106二倍体细胞 含 DNA 的量分别为 7.1pg,6.5pg,5.8pg。预期产量:1mg组织或1x106细胞提取DNA分别为肝和肾34pg骨骼肌,脑组织, 胎盘23pg人,大鼠,小鼠培养细胞(1x106) 57pg成纤维细胞57pg。应用:1. 用于 PCR 溶于 8mM NaOH 的 DNA用 0.1M HEPES 调 pH
13、至 8.4,取 0.1 1pg DNA 用作模板。2. 酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每pg DNA使用35单位的 酶,8090%的DNA是可消化的。1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES(pl) Final pH 1M HEPES(pl)8.4 86 7.2 238.2 93 7.0 328.0 1017.8 1177.5 159注意事项:1. DNA在中间层和有机相中时可在28C保存过夜。2. DNA沉淀在75%乙醇中28C可保存几个月。3. DNA在8mM NaOH溶液中4C可放置过夜,如长期保存需用HEPES调
14、节pH至7 8并且加EDTA至1mM,可置于4C或-20C长期保存。常见问题分析:得率低:A. 样品匀浆和裂解的不彻底。B. 最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。A260/A2801.70 :A. 检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了 TE中。B. 酚除去的不彻底,可用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)再洗一遍DNA沉淀。DNA降解:A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C。C. 样品匀浆时使用了高速匀浆仪。RNA污染:A. 氯仿分层后水相去除的不干净。B. DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)洗的不彻底。蛋白
15、质的提取准备试剂:异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。操作步骤:1取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙 醇,室温放置10分钟,28C12000xg离心10分钟弃上清。2用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液, 室温放置 20 分钟, 28C7500xg 离心 5 分钟,弃上清,重复两次。用 2ml 无水乙醇同样 方法再洗一次。3真空抽干蛋白质沉淀510分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50C温浴使 其完全溶解,不溶物28C10000xg离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于 Western Blot 或-5 至-20 C保存备用。注意事项:1蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中28C一个月以上或 -5至-20C年以上。2.用0.1% SDS在28C透析三次,10000xg离心10分钟取上清即可用于Western Blot。常见问题分析:得率低:A. 样品裂解或匀浆处理不彻底。B. 最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解:组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形:蛋白质沉淀洗涤不充分。