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1、,耐药结核病的产生 与实验室诊断 2014年6月21日,耐药结核病产生,几个与耐药相关的概念,原发耐药 获得（继发）性耐药 自然耐药 交叉耐药 初始耐药,单耐药 多耐药 耐多药 广泛耐药,几个与耐药相关的概念,原发耐药：以前未接受过抗结核药物治疗而发生的耐药。大多是受到耐药病人的传染而获得的。 获得（继发）性耐药：原来对抗结核药敏感的病例在治疗过程中发生的耐药。一般是治疗不当所致。 初始耐药：原发耐药和不能肯定的获得性耐药的总称，经临床核实无法证明病人以往未曾接受过治疗,几个与耐药相关的概念,自然耐药：是野生株中存在的耐药菌，在无药物存在的条件下自然对抗结核药物产生的耐药。自然耐药菌可因结核病
2、治疗用药不当、剂量不足、疗程不充分等选择性的生长发育，最终形成继发耐药菌。 交叉耐药：结核菌对一种药物耐药的同时对其他药物也产生耐药。可以是两种或多种药物间的交叉。1314TH与1312TH完全交叉耐药；氨基糖甙类单向交叉耐药：耐SM对KM、AK敏感，耐KM对AK、CPM敏感；氟喹诺酮类药物间完全交叉耐药，但对其他类无交叉耐药；环丝氨酸和特立齐酮完全交叉耐药，但对其他类无交叉耐药。,几个与耐药相关的概念,单耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物耐药 多耐药：结核分枝杆菌对不包括同时耐R、H在内的一种以上的抗结核药物耐药 耐多药：结核分枝杆菌至少同时对R、H耐药 广泛耐药(严重耐多药）：结核分枝杆菌
3、对R、H耐药，同时对任何氟喹诺酮类药物耐药，以及至少对一种二线抗结核注射剂（CS、KM、AK）耐药,耐药结核病产生的原因,细菌学、临床及规划的原因，本质是人为造成的结果 微生物学观点，耐药性是基因突变引起药物对突变菌效力降低造成的，是由于敏感菌株被抗结核药物杀死所诱发的某些菌群选择性耐药突变的结果 临床及管理方面，不足够或不恰当的治疗导致患者体内耐药突变菌成为优势菌,耐药结核病产生的原因,细菌学原因：结核分枝杆菌在生长过程中可以自发、独立的发生抗结核药物耐药的自然突变，但野生型菌株中突变率低，耐药突变更低，在特定的野生型中 耐异烟肼的突变3.5x10-6 耐利福平的突变1.2x10-8 耐乙胺
4、丁醇的突变3.1x10-5 耐链霉素的突变3.8x10-6 野生型中对一种以上药物耐药很少见，是两率的积,耐药结核病产生的原因,治疗和管理原因：治疗和管理不合理性是造成耐药结核病最重要和最直接的原因，不合理性包括： 结核病防治规划组织执行不到位，没有按国家指南要求开展结核病防治工作 没有可靠的耐药结核病规划管理指南 没有足够培训 缺乏对治疗的监测,耐药结核病产生的原因,药物联合不合理、不恰当 用药剂量不足，服药方法不当 疗程不足或间断用药 对失败和复发的病例未做深入的分析和给予恰当的处理 对患者的治疗缺乏管理或管理不善,耐药结核病产生的原因,其他原因： 患者的依从性差 患者对结核病知识的了解不
5、足 抗结核药物供应不足，种类不全，质量不佳，不良反应重，生物利用度低等直接影响治疗效果 经费不足，患者经济困难是造成间断、不规则用药的重要原因 新药研制的缓慢,结核分枝杆菌耐药机制,目前对结核分支杆菌耐药机制研究很多，但仍然还没完全搞清楚，现在主要有以下3种观点 细胞壁结构与组成发生变化，使细胞壁通透性发生改变，药物通透性降低，产生降解或灭活酶类，改变了药物作用靶位 结核分支杆菌中存在活跃的药物外排泵系统，将菌体内药物泵出，使胞内药物浓度不能有效抑制或杀死细菌，从而产生耐药性 分子机制：结核分枝杆菌基因组上编码药物标靶的基因或与药物活性有关的酶基因突变，使药物失效产生耐药,耐药结核病的流行,耐
6、药结核病是全球结核病控制工作的严峻挑战， 世界卫生组织估计，全球每年新产生耐多药结核病患者50万人、广泛耐药患者约5万人。能及时得到诊断者不足四分之一。 我国结核患者数和耐多药患者数均居世界第二位，,耐药结核病的流行,2007-2008年我国进行的耐药基线调查结果：涂阳肺结核患者结核分枝杆菌总耐药率为37.79%，其中初治总耐药率为35.16%，复治总耐药率为55.17%，总耐多药（MDR-TB）率为8.32%，其中初治总耐多药率为5.71%，复治总耐多药率为25.64%，总广泛耐药（XDR-TB）率为0.68%，其中初治患者为0.47%，复治患者为2.06%，根据此次调查结果估算，我国每年新
7、发耐多药肺结核患者12万例，广泛耐药患者近1万例。,耐药结核病的流行,1999年我省结核分枝杆菌耐药监测结果，30个监测点，总入选病例1136例，培阳1097例，培阳率96.6%，涂阳培阴34例，3.0%，污染5例，污染率0.4%，未发现非结核分枝杆菌，1097例中初始859例，获得238例，总耐药率23.3%，初始耐药率17.5%，获得性耐药率44.5%，总耐多药率6.4%，初始耐多药率2.1%，获得性耐多药率21.8%。,耐药结核病诊断,药敏试验,目的：诊断 耐药治疗 监测 诊断耐药结核病，满足对临床结核病患者耐药情况的判定。 选择和调整耐药结核病治疗方案、制定有效的标准化或个体化治疗方案
8、。 开展耐药监测了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平和流行趋势。,药敏试验方法,基于检测标本 直接方法 直接用涂阳(涂片1+以上)标本进行试验 优点：快速得到结果，较好地反应病变部位菌群的耐药性； 缺点：污染难控制，容易失败，很难确定接种量/菌活性。 间接方法 使用培养物进行药敏试验 优点：更好地控制接种量/菌活性 缺点：耗时长，及时性差,试验方法,世界卫生组织推荐的药敏试验方法 基于生长观察： 固体培养方法 比例法 绝对浓度法 抗性比率法 基于生长检测（产生二氧化碳、 消耗氧气等） 液体培养法 基于基因突变检测 探针杂交的方法 基因扩增及序列测定,传统试验方法,比例法 法国的 Canetti
9、, 1963 在临界药物浓度下的耐药比例，能够更好的克服由接种量引起的变化 临界菌群比耐药菌群数/全菌群数 1% 、10% 绝对浓度法 德国的 Meisnner， 1963 标准化的接种量; 梯度的药物浓度 临界药物菌落数（10、20菌落） 抗性比率法 英国 Mitchson， 1963 RR= MIC被检菌/MICH37Rv克服了培养基中药物浓度的控制 方法比较繁琐，现在基本不怎么使用。,比例法和绝对浓度法的一致性,比例法和绝对浓度法目前是我国常用的药敏实验方法，综合以往国内相关报道，两种方法测试一线4种药的一致性非常好，均达到了96%以上，耐药率无显著性差异。目前全球基金项目和国家对省级和
10、省级对市级质控都采用了比例法，也与跨国实验室质控方法一致，与国际上逐步实现了接轨。,开展传统药敏实验的要求,程序复杂: 必须在有质量保证的通过熟练度测试的实验室中开展； 必须按照高致病性病原微生物的要求进行检测； 实验室应为P2及以上级别的实验室，应有生物安全柜和防止气溶胶产生的仪器和设备； 必须按标准化的操作流程进行试验； 良好的个人防护措施以及定期对操作人员进行体检并进行生物安全培训和教育； 实验室应有完善的规章制度和应急预案等。 应用：应与PMDT的扩展、治疗策略和能力相一致,不同实验室操作（韩国）实验室工作人员结核感染风险的比率,比例法药敏试验方法,比例法药敏试验流程,对照培养基,含药
11、培养基,药物储存液,混合、摇匀,基础液 改良L-J,100ml,1ml,磨菌,分装 凝固,分装 凝固,1mg/ml菌悬液,10-4 mg/ml,10-2 mg/ml,100倍稀释,100倍稀释,接种0.01ml,接种0.01ml,2-3周 新鲜菌落,结果报告,计算耐药百分比： 含药培养基上生长的菌落数 耐药百分比= - 100% 对照培养基上生长的菌落数 若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。,结果计算,对照管应能计算出实际菌落数 4周后观察结果，如果生长不良，可稍延后报告结果，但不能超过6周.耐药菌长的慢，药效丧失）,结果报告,无药 Isoniazid Ethambuto
12、l 接种物 培养基 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 + + 3 10-5 26 9 0 耐药百分比 34.6 0.1 结果解释 耐药 敏感,影响药敏试验准确性的因素,实验室布局、设备、物资是否满足要求 负责培养和药敏试验人员的能力 工作量的保证 药物保存不当、浓度计算错误、效价计算不准确，稀释不准确影响药物的实际浓度 药敏试验方法选择不当 培养物：菌的新鲜程度、传代次数、代表性,影响药敏试验准确性的因素,培养基：药物加入到不同培养基后活性的改变（含药培养基的制备），培养基中某些拮抗剂或化学物质可干扰药物的作用，培养基中药物浓度变化（加热失活、过滤除菌、不适宜的溶剂导致的不
13、完全溶解） 接种： 接种量、菌液的分散度（R、S）、代表性，稀释度，菌的活性； 稳定的孵育条件孵育温度和时间 耐药的标准 药敏试验结果的判读,质量控制,若高稀释度菌液（10-4mg/ml）在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。 每批试验以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv敏感株） 做为敏感对照，以检测含药培养基的质量、稀释和接种量等因素。,室内质控,对照培养基的质控 可接种快速生长分枝杆菌，如偶然分枝杆菌，如接种后5天还未长出菌落，则培养基 未达到质量要求。 药敏培养基的质控 菌株H37Rv（ACTT27294）,实间质控,药敏试验的熟练度测试 对进行药敏试验
14、的菌株进行系统的（耐药株）或随机（敏感株）抽查，并采用双盲进行测试比较。,抗结核药物敏感性试验熟练度测试,从2008年开始，省结核病参比室每年对宜昌、武汉、荆州、咸宁、黄冈五个地市结防院所结核病实验室进行一、二线抗结核药敏试验熟练度测试。 2013年对全省16个地市结防专业机构实验室、耐药定点医院实验室、专科医院实验室进行培训和测试，除一个实验室一线药，两个实验室二线药结果不合格外，其他实验室结果非常理想。,药敏试验的局限性,药敏试验准确性高低与测试的药物有关； 对于一线药物，INH、RFP准确性高，而SM、EMB和PZA的可靠性和重复性较差。 对于二线药物如氨基糖苷类、多肽类和氟喹诺酮类的药
15、敏试验重复性和可靠性较好，其他二线药尚无可靠的药敏试验方法 可靠性差的原因 与临床反应的相关性：临界耐药浓度、体外试验不一定完全反应药物在体内的作用 方法本身的复杂性和不稳定性,药敏试验的局限性,药物浓度的不稳定，蛋白结合、热灭活、不完全溶解、过滤除菌和药物效价变化等均可导致药物损失。 实验操作、培养基的PH值、孵育的温度和时间都可影响药敏试验结果。 二线药敏试验的临界浓度与药物的最小抑菌浓度接近，加大了敏感和耐药的错分几率，导致可重复性较差。 二线药物有交叉耐药，分子机制不详。 二线药敏试验结果的解释： 报告耐药：很有可能治疗无效 报告敏感：需要谨慎解释（结合用药史和临床反应）,说 明,医生
16、应该详细了解病人的病史、准确记录用药史，用药时间越长，耐药的可能性就越高。特别是常规治疗期间出现临床或细菌学治疗失败（涂阳或培阳）则高度提示耐药的产生。如果病人治疗超过1月仍涂阳或培阳，即使药敏结果报告为敏感，也要考虑该药物“可能耐药”。如果某一药物的既往用药史提示可能由于耐药而无效，即使实验室报告该药敏感，也不能将其作为方案中的四个核心药物。实验室报告耐药，而病人从未使用过该药物的可能性也存在，有可能感染的是原发性耐药株，也可能是实验室的错误或某些二线药物药敏试验特异性有限所致。,国家参比室推荐的耐药新诊断技术,其他正在开发或评估的新技术,耐药分子诊断的基本原理,利福平/异烟肼耐药性的产生与
17、结核分枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。,快速药敏-商业化线性探针检测（LPAs）,可使用涂阳痰标本和培养物进行操作 快速（1天） 需PCR实验室设施和技术 不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变 价格比较昂贵,42,43,去 污 染,DNA 提取,扩 增,杂交,清洗，检测颜色,结果解释,LPA操作流程,关于LPA的建议,适用于地区及以上级实验室 仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测 操作需要至少有3个独立的实验室以避免交叉污染 仅能检测MDR，XDR的检测仍需要依靠传统药敏试验 可以独立作为MDR的诊断工具 对于MDR病人，仍需要传统的培养（固体或液体培养）检测治疗效果（培养阴转）
18、 建议的覆盖面: 每50100万人口至少需要1个LPA实验室,结核耐药检测基因芯片,激光共焦扫描仪,软件判读,结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书,样品制备仪,杂交仪,通 量：两个一线抗结核药 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍） 灵敏度：103 CFU/反应 特异性：对照设计严谨；自动判读,基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。,International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）,45,获国
19、家医疗器械证书和欧盟CE认证,基因芯片,基因芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,检测过程,芯片结果图例,芯片杂交质控,国家推荐意见,在地市级以上结核病诊断实验室使用 用于涂阳患者或者阳性培养物,Xpert MTB/RIF,检测结核分枝杆菌 检测利福平耐药 直接标本检测 100分钟可获得结果,Xpert MTB/RIF,生物安全要求低 敏感度和培养类似 特异度高 快速 ( 2 小时) 设备轻便 操作简单,成本高 设施设备 耐
20、药的阳性预测值取决于P利福平耐药率 利福平耐药 MDR-TB,WHO关于Xpert MTB/RIF的建议,Xpert MTB/RIF 应该用于怀疑MDR-TB的病人、以及HIV合并结核的病人的最初诊断（强烈推荐） Xpert MTB/RIF 在MDR或HIV问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测（根据具体情况推荐，需考虑当地的资源）,说明:,Xpert MTB/RIF适用于痰标本（包括去污染后的痰标本），肺外标本应用 Xpert MTB/RIF 的研究十分有限。 增加检测次数可能会增加Xpert MTB/RIF的敏感性，但是需要考虑资源情况 上述建议也适用于儿童 不能取代传统的涂片检查、培养和药敏试验（治疗监测、流行病学调查、其他一线药物以及二线药物的药敏试验） 在MDR低风险组（如新病人）Xpert MTB/RIF检测结果为利福平耐药者，建议用传统药敏试验或LPA进行确认,分子耐药检测优缺点,优点：快速、微量，敏感度、特异度较高 缺点： 1、检测的突变位点有限，常只能检出部分热点突变，因此对RFP阳性检出率为90%，INH为70%以上 2、检出的药品种类有限 3、多数方法操作较繁琐，影响因素较多，需要专门设备，且设备、检测试剂价格较贵，临床应用还存在一些难度,谢谢,