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1、Prokaryotic and eukaryotic chromosome structure,D1 prokaryotic chromosome structure D2 chromatin structure D3 eukaryotic chromosome structure D4 genome complexity D5 the flow of genetic information,D1 Prokaryotic chromosome structure,The Escherichia coli chromosome DNA domains DNA-binding proteins,T
2、he Escherichia coli chromosome,A single closed-circular dsDNA molecule Total length: 1300 m Molecular weight: 2.8*109D Base pairs: 4.6 Mb The number or genes : 3000-4000 The structures, functions and locations in gene map of 1400 genes have been confirmed. Nucleoid: no nucleic membrane, no nucleolus
3、, no fixed configuration, simple structure,Nucleoid,大肠杆菌基因组为双链环状的DNA分子，在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核（nucleoid）,其上结合有类组蛋白和少量RNA分子，并压缩形成一种脚手架形的（scaffold）致密结构。 该区域DNA浓度高达3050mg/ml。正常生长时，DNA保持持续复制。生长时，DNA持续复制，生长速率最大时，每个细胞平均有基因组的两个拷贝。 大肠杆菌及其他原核细胞就是以这种拟核形式在细胞中执行着诸如复制、重组、转录、翻译以及复杂的调节过程。 基因组全序列测定于199
4、7年由Wisconsin大学的Blattner等人完成。,DNA domains,The DNA consists of 50-100 domains or loop. Each domain has supercoiling of different level. The E.coli chromosome as a whole is negatively supercoiled. The ends of domains are constrained by binding to a structure which probably consists of proteins attached
5、 to part of the cell membrane. The loops are about 50-100kb in size. The domains are wrapped by nonspecifical histone-like proteins such as HU and H-NS, so half of the supercoilings are constrained. RNA polymerase and mRNA molecules and site-specific DNA-binding proteins such as integration host fac
6、tor (IHF) may be important in the organization of the DNA domains. highly ordered DNA-protein complexes such as nucleosomes have not been detected.,Supercoiling of the genome,DNA-binding proteins,H 两个28KD的相同亚基 30000个二聚体 HU 两个9KD的不同亚基 40000个二体聚体 HLP1 17KD的亚基 20000个单体 P 3KD的亚基 未知 这些DNA结合蛋白，使E.coli 染色体
7、DNA压缩成为一个脚手架形结构，结构中心是多种DNA结合蛋白，DNA双螺旋分子有许多位点与这些蛋白结合，形成约100个小区，每个小区的DNA都是负超螺旋，一个小区的DNA有两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。,HU,HU被称为类组蛋白(histone-like protein)。 在动物、植物细胞里，很长很长的DNA分子靠一些叫做组蛋白(histones)的蛋白质来组织、压缩，才能装进空间较小的细胞核。 在细菌细胞内，HU被认为起类似组蛋白的作用。HU由两个相似的亚基构成，分别称为HU-和HU-。两个亚基各形成一个类似受臂的结构，将双螺旋的DNA分子抱住。,D2 Chromatin str
8、ucture,Chromatin Histones Nucleosomes,Chromatin,The total length of DNA in a eukaryotic cell depends on the species, but it can be thousands of times as much as in a prokaryotic genome. The DNA is made up of a number of discrete bodies called chromosomes. Each chromosome is a single linear molecule,
9、 which can be up to several centimeters long. Chromatin: a highly organized complex of DNA and protein （11） Chromatin and chromosome,Chromatin and chromosome,染色质（chromatin）: 指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构, 是间期细胞遗传物质存在的形式。 染色体(chromosome): 指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中, 由染色质聚缩而成的棒状结构。 染色质与染色体是在细胞周期不同的 功能阶段可以
10、相互转变的的形态结构 染色质与染色体具有基本相同的化学 组成，但包装程度不同,构象不同。,Histones,Most of the protein in eukaryotic chromatin consists of histones. Five families: Core histones: H2A, H2B, H3 and H4 H1 All histone proteins have a large positive charge, between 20 and 30% of their sequence consist of the basic amino acids, lysin
11、e and arginine. This means that histones will bind very strongly to the negatively charged DNA in forming chromatin.,染色体中的五种蛋白,核心组蛋白,Small proteins, with masses between 10-20kDa 核心组蛋白的基因非常保守。亲缘关系较远的种属中, 四种组蛋白(H2A、H2A、H3、H4)氨基酸序列都非常相似. e.g. 海胆组织H3的氨基酸序列与来自小牛胸腺的H3的氨基酸序列间只有一个氨基酸的差异； 小牛胸腺的H3的氨基酸序列与豌豆的H3
12、只有4个氨基酸不同。,H1组蛋白,H1的分子量较大，约23kDa 不同生物的H1序列变化较大, 在某些组织中，H1被特殊的组蛋白所取代。 e.g. 成熟的鱼类和鸟类的红细胞中H1 被H5 取代, 精细胞中则由精蛋白代替组蛋白。 H1更易从染色质中提纯 其存在量为其他几种核心组蛋白的一半,Nucleosomes,Supporting proofs according to experiments Structure of nucleosomes The role of H1 Linker DNA The 30nm fiber Higher order structure,主要实验证据,铺展染色质
13、的电镜观察 未经处理的染色质自然结构为30nm的纤丝，经盐溶液处理后解聚的染色质呈现10nm串珠状结构 用非特异性微球菌核酸酶消化染色质，部分酶解片段分析结果 应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术研究，发现核小体颗粒是直径为11nm、高6.0nm的扁园柱体，具有二分对称性，核心组蛋白的构成是先形成（H3）2（H4）2四聚体，然后再与两个H2AH2B异二聚体结合形成八聚体 SV40微小染色体分析与电镜观察,核小体结构要点,每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1 组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构 146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75
14、圈, 组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。包括组蛋白H1和166bp DNA的核小体结构又称染色质小体。 两个相邻核小体之间以连接DNA 相连，典型长度60bp，不同物种变化值为080bp。 组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列，实验表明，核小体具有自组装的性质。 核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响基因表达,The role of H1,One molecule of histone H1 binds to the nucleosome, and acts to stab
15、ilize the point at which the DNA enters and leaves the nucleosome core. In the presence of H1, 166bp (146+20) of DNA is protected from nuclease digestion. A nucleosome core plus H1 is known as a chromatosome. The larger size of H1 compared with the core histones is due to the presence of an addition
16、al C-terminal tail, which serves to stabilize the DNA between the nucleosome core.,Linker DNA,“beads on a string” structure: globular particles (nucleosomes) thin strands of DNA The average length of linker DNA between core particles is 55bp, but the length varies between species and tissues from al
17、most nothing to more than 100bp.,The 30nm fiber,The nucleosomes are wound into a higher order left-handed helix, dubbed a solenoid with 30nm diameter. around six nucleosomes per turn,Higher order structure,Primary structure: nucleosome Secondary structure: solenoid Tertiary structure: chromosomal lo
18、op Quaternary structure: chromatin 压缩7倍 压缩6倍 DNA 核小体 螺线管 染色体环染色单体,Primary structure: nucleosome,核小体，可视为染色体DNA的一级包装，即由直径2nm的DNA双螺旋链绕组蛋白形成直径11nm的核小体“串珠”结构。若以每碱基对沿螺旋中轴上升距离为0.34nm计，200bpDNA(一个核小体的DNA片段)的伸展长度为68nm，形成核小体后仅为11nm(核小体直径)，其长度压缩了6-7倍。在低离子强度和去H1组蛋白的条件下,电镜下可清晰地看到染色体一级包装的核小体纤维。,Secondary structur
19、e: solenoid,若增大离子强度，并保留H1，通过电镜可观察到10nm纤维会折转成较粗的30nm纤维，这种纤维即染色体DNA的二级包装。 目前较公认的二级包装结构模型是螺线管纤维。它是由核小体纤维盘绕形成的一种中空螺线管，其外径为30nm,每圈含6个核小体。因此，螺线管的形成使DNA一级包装又压缩6倍。若以充分伸展的DNA双螺旋论，每个螺线管包含了408nm(668nm)长度的DNA链，而每圈螺线管的长度几乎等于核小体直径，即11nm，故染色体的二级包装相当于将DNA长度压缩了近40倍。H1组蛋白在维持毗邻核小体的紧密度及核小体纤维折转形成螺线管中起了重要作用。,Tertiary str
20、ucture: chromosomal loop,螺线管纤维基础上的更高一级包装是形成环状螺线管。 电镜观察结果提示，这种结构是30nm纤维缠绕在一个由某些非组蛋白构成的中心轴骨架上形成的。即螺线管纤维相隔一定间距的某些区段被“拉拢”固定在蛋白轴上，从而产生了许多从骨架上伸出的纤维环。动物细胞中每个纤维环包含了5-1010kbDNA,这显然使螺线管纤维得到了较大程度的压缩。 据认为,纤维环的形成是基因表达较理想的结构。这些环状区是基因表达的活性单位所在。从纤维环DNA比其它区域有更伸展的结构来理解这一点似乎是合理的.,Quaternary structure: chromatin,上述三级包装
21、完成后,DNA链被压缩的程度仍远不足以形成能被细胞核容纳的染色体.具环形区的螺线管纤维需进一步以某种方式盘绕、折叠,最终完成细胞生长和繁殖的不同时期的染色体包装.这种在更高层次上的复杂的包装是以何种方式进行的,目前尚无明确定论.但无疑是染色体DNA包装的重要内容.,D3 Eukaryotic chromosome structure,The mitotic chromosome Interphase chromosomes DNase I hypersensitivity CpG methylation Histone variants and modification,The mitotic
22、 chromosome,conformation of chromatin in mitosis or meiosis most highly condensed state Two identical sister chromatids join at their centromeres. The tips of the chromosomes are the telomeres, which are also the ends of the DNA molecule. Structure of chromosome,Structure of chromosome,Centromere (p
23、rimary constriction) Secondary constriction NOR Satellite Telomere,The centromere,primary constriction the site of two identical sister chromatids joined the site of assembly of the kinetochore The DNA of the centromere has been shown in yeast to consist merely of a short AT-rich sequence of 88 bp,
24、flanked by two very short conserved regions. In mammalian cells, centromeres seen to consist of rather longer sequences, and are flanked by a large quantity of repeated DNA, known as satellite DNA.,Telomeres,Telomeres are specialized DNA sequences that form the ends of the linear DNA molecules of th
25、e eukaryotic chromosomes. The biochemical function of telomeres are maintaining the stability of chromosomes. A telomere consists of up to hundreds of copies of a short repeated sequence, and the sequences are highly-conserved. e.g. 5-TTAGGG-3 in human It is synthesized by the telomerase by reverse
26、transcription.,荧光原位杂交显示的端粒（上）和端粒序列（下）,Interphase chromosomes,In interphase, the genes on the chromosomes are being transcribed and DNA replication take place (during S-phage). The chromosomes adopt a much more diffuse structure. Type Euchromatin Heterochromatin,Euchromatin,构成不均一 染色体环所在位置非常不活跃。 基因进行活
27、跃转录的部位呈疏松的环状，电镜下表现为浅染，为解螺旋状态。 在遗传行为上表现为活性； 易被核酸酶在一些敏感的位点（hypersensitive sites）降解。,Heterochromatin,The chromatin remains highly compacted in interphase, although not so compacted as at metaphase. consist of the repeated satellite DNA close to the centromeres of the chromosomes Heterochromatin is tran
28、scriptionally inactive (inactive chromatin). Genetic inertia Heteropycnosis The two X chromosomes in female mammals are heterochromatin.,异染色质（核内深染部分）和常染色质（核内浅染部分）,DNase I hypersensitivity,当一个基因成为转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对DNase（一种内切酶）的敏感性要比无转录活性区域高得多。这是因为DNase 可切割裸露DNA，由于此区域染色质的DNA蛋白质结构变得松散，DNase易于接触到DNA。
29、 较长的敏感区域意味着该区域正在进行转录，因此染色质对DNase 的敏感性可被用来定位细胞中具转录活性的染色质。 e.g.鸡的珠蛋白和卵清蛋白系统,鸡的珠蛋白和卵清蛋白系统,鸡胚红细胞的核中，珠蛋白的基因对DNase的降解是敏感的，而编码卵清蛋白的基因在红细胞中不表达，因此它对DNase的降解具有抗性。 相反，在母鸡输卵管细胞的核中，卵清蛋白的基因具有转录活性，但却不能产生珠蛋白的RNA，卵清蛋白基因的序列对DNase 的降解要比珠蛋白基因的序列敏感得多。 实验步骤 实验结果,实验步骤,实验以克隆的特异基因为探针，应用Southern杂交技术来论证DNA序列对DNase敏感性的改变。 用不同浓
30、度的DNase来处理样品，然后从各染色质样品中抽取DNA，再用限制性酶BamHI来降解（它可在珠蛋白基因两侧中的任一侧剪切，两个 BamHI位点在染色体DNA上相隔4.5kb）。此DNA片段经琼脂糖电泳并通过Southern吸印技术转移到尼龙膜上，此膜和放射性珠蛋白探针进行分子杂交，来确定珠蛋白基因DNA片段的大小，从而可以推断是否被DNAase降解过。,实验结果,红细胞中提取的染色质，珠蛋白基因含有的DNA片段看来随着DNase浓度的增加，4.5kb BamH1-BamH1逐渐消失，表明含有珠蛋白基因的染色质片段对DNase的降解是敏感的，即珠蛋白的基因区域染色质组成是松散的，珠蛋白基因DN
31、A序列很容易和DNase接触。 实验对照，从对照组细胞(不产生珠蛋白)中分离的染色质，其4.5kb BamH1 DNA片段未被任何浓度的DNase所降解。此结果表明不产生珠蛋白的细胞中相关的染色质是高度凝聚的。所以珠蛋白的基因序列不易于和DNase接触，从而不发生降解。,用克隆的卵清蛋白基因为探针，来分析红细胞中的卵清蛋白基因（用BamH1酶来处理，可切成20-Kb DNA片段）表明卵清蛋白基因对DNase的降解不敏感，20-Kb BamH1-BamH1 DNA片段在各种浓度的DNase作用下依然存在，结果表明在细胞中不产生卵清蛋白，因此基因组中这一区域并不变得松散。 很多这类实验得出的结论几
32、乎都是有转录活性的基因对DNase的敏感性增加，DNase敏感区的范围随着基因序列的不同而变化，从基因周围几个Kb到两侧20Kb大小不等。,Hypersensitive region,仔细分析具有转录活性基因周围的DNA区域，表明有一个中心区域存在，称为超敏感区域（hypersensitive region）或超敏感位点（hypersensitive site），它对DNase是高敏感的。这些位点或区域将首先受到DNase的剪切。 对DNase的敏感性反映了染色质中DNA的有效性，我们将这些位点描述为染色质中特殊DNA暴露区域，一般在转录起始点附近，即5端启动子区域，少部分位于其它部位如转录单
33、元的下游。,超敏感位点位于转录起始之前，转录的诱导物除去后虽超敏感位点仍然存在，但转录却很快停止，说明超敏感位点的存在是转录起始的必要条件，但不是充分条件。 超敏感位点是一段长200bp左右的DNA序列，这些区域是低甲基化区；并可能有局部解链的存在；不存在核小体结构或结构不同寻常，此区域因DNA的裸露，易和多种酶或特异的蛋白质结合，也就是说易于和反式作用因子结合。,HMG14 and HMG17,染色质对DNase的敏感性与2种非组蛋白有关，高泳动蛋白14（HMG14，high-mobility group）和HMG17，这是两种高丰富度小分子量（30KDa）的蛋白。活化染色质中，每10个核小
34、体就结合一个HMG分子，当从红细胞中提出这两种蛋白时，珠蛋白基因不再对DNase出现敏感，当将这两种蛋白重新加入到此系统中，敏感性又可得到恢复。 HMG蛋白的C端含活性氨基酸，可与核小体核心组蛋白的碱性区域相结合。HMG蛋白的N端1/3的区域氨基酸序列与H1和H5的C端十分相似。而HMG在核小体上位置与H1相近，HMG和组蛋白相互作用。可以竞争性取代H1或H5，核小体缺乏H1和H5将使染色质变得松散，成为具有转录活性的状态。,影响染色质活性的其他因素,除HMG以外可能还有别的因素会影响到染色质的活性，当把上述两种HMG加入鸡脑细胞的染色质中，其中珠蛋白基因所在区域并不表现出对DNase的敏感，
35、表明红细胞和脑细胞还存在其它因子的差异，这些因子在盐抽提后仍留在染色质中，它们决定了红细胞珠蛋白基因区域在HMG14和HMG17存在时对DNase敏感。,CpG methylation,真核生物基因组中存在着广泛的甲基化，DNA甲基化主要发生在CpG岛的5C上，其作用是导致基因的失活。一般说，DNA甲基化程度越高，这段DNA被转录成RNA并翻译成有功能蛋白质的可能性越小。甲基化作用好像是基因组用来防御寄生性遗传元件（parasitic genetic elements），如转座子转移的。 哺乳动物DNA中5CG3序列通常在胞嘧啶碱基处被甲基化，它与染色质中的非转录区相连。 基因组中还有未甲基化
36、的CpG“岛”，包围着持家基因的启动子区域，形成DNase 敏感区。,Histone variants and modification,组蛋白的共价修饰可通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性，从而改变染色质的松散或凝集状态，来调节基因的表达。组蛋白共价修饰研究较为深入的是组蛋白乙酰化和甲基化。 组蛋白乙酰化 组蛋白甲基化 其他组蛋白修饰方式 通过乙酰化或磷酸化等化学方法对组蛋白进行修饰，可以引起染色质结构的改变，从而导致基因活性的改变。,组蛋白乙酰化,组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰转移酶（TACs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）协调进行的，主要发生在组蛋白N末端的赖氨酸，组蛋白乙酰化呈多样性，核
37、小体上有多个位点可提供乙酰化，但特定基因部位的组蛋白乙酰化和去乙酰化以一种非随机的、位置特异的方式进行。 e.g. IFN-基因启动子附近组蛋白赖氨酸（H4 K8,H3 K9和K14）乙酰化，该表面能与特异的蛋白识别模块（protein recognition modules）结合。H4 K8修饰产生的特异信号是SWI/SNF复合物BRG1组分的识别结合面（binding surfaces），而H3 K9和K14修饰产生的信号是TFIID组分TAFII250的识别结合面。因此，这些特异的蛋白识别面代表了IFN-启动子组蛋白乙酰化“密码”，并参与IFN-转录激活作用的调节。,组蛋白甲基化,组蛋白
38、甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histone methyltransferases）完成的，甲基化可发生在赖氨酸和精氨酸残基上，赖氨酸残基能够单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这就极大的增加了组蛋白修饰调节基因表达的复杂性。 当前的证据表明，组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记，精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4靶精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控较为稳定的标记，例如，H3 第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关,其他组蛋白修饰方式,其他几种方式如磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等等
39、。 这些修饰可能通过两种机制影响染色体的结构与功能。首先，这些修饰几乎都能改变组蛋白的电荷，因此改变了组蛋白与DNA结合的特性；第二，这些修饰能够产生蛋白识别模块(protein recognition modules)的结合表面，因此能募集专一蛋白复合物到它们的表面起作用。所以有人称这些能被专一识别的修饰信息为组蛋白密码，所有这些组蛋白密码组合变化非常多，因此,组蛋白共价修饰可能是更为精细的基因表达方式。,D4 genome complexity,Noncoding DNA Reassociation kinetics Unique sequence DNA Tandem gene clus
40、ters Dispersed repetitive DNA Satellite DNA Genetic polymorphism,Noncoding DNA,The genomes of complex eukaryotic organisms may contain more than 1000 times as much as prokarytotes. Much of the DNA does not code for protein. The coding regions of gene are interrupted by intron sequence and genes may
41、take up many kilobases of sequence but genes are by no means contiguous along the genome, they are separated by long stretched of sequence for which the function unknown. Much of this noncoding DNA consists of multiple repeats of similar or identical copies of a few different type sequence. These co
42、pies may follow one another directly (tandemly repeated). e.g. satellite DNA They may occur as multiple copies scattered throughout the genome (interspersed). e.g. Alu elements,垃圾DNA中发现不编码蛋白质的新型基因,科学家用垃圾DNA来描述那些未加利用的人类基因组DNA片断，它们包括一些长的没有已知功能的DNA链。 2004年12月17日发表的science杂志以“隐藏的DNA财富”为题，将非编码DNA的研究工作列为2
43、004年度十大科学突破之一。 人类基因组有3-4万个基因。基因组的很大部分为垃圾DNA，科学家正努力找出垃圾DNA大量存在的原因，并通过它们找到潜在的治疗疾病的方法。,美国哈佛医学院的研究人员表示，他们在酵母基因组的垃圾DNA中发现了一种新基因。与其它基因不同，这个新基因并不编码蛋白质或者酶以表现出功能。但当这个基因开启时，它将调控临近基因的表达。“这并不能解释所有垃圾DNA。它表明了部分垃圾DNA的潜在用途。” 新发现的基因名为SRG1，它能够利用转录获得的RNA屏蔽或者压制酵母基因组中临近基因的功能。温斯顿及其研究小组将这项发现发表于最新一期nature杂志。他们认为肯定有其它基因以同样的
44、方式起作用，其它生物体的基因组中也应该存在这种基因，包括人类。,真核基因组的一般实质可以由变性DNA 的复性动力学方程(Kinetics of reassociation)获得。DNA 互补链的复性通过碱基配对发生，它与DNA 分离的变性过程相反。复性反应的动力学方程反映了存在多种序列，因此这个反应可用来定量基因和RNA 产物。,Reassociation kinetics,The genome sequence complexity was studied using measurements of the annealing of denatured DNA. Experiment the
45、ory Experiment process Conclusions Repetitive sequence,不同物种基因组大小差异的原因,大的基因组含有更多的不同基因？或含有在小基因组中出现的小基因更多拷贝? 该问题可以直接用基因组序列来回答，但目前我们只了解少数种属(相对较小)的有关信息。 基因的多样性随着基因组大小而增加，我们可以认为基因组中不同DNA 序列会增加，但不会只增加相同基因拷贝数。,Experiment theory,Genomic DNA fragments of a uniform size normally prepared by shearing of sonicat
46、ion are thermally denatured and allowed to re-anneal at a low concentration (25). The fraction of the DNA which is reassociated after a given time (t) will depend on the initial concentration of the DNA, C0. The reassociation rate of DNA is also correlated with the genome sequence complexity and rep
47、etition degree.,C0对复性速率的影响,浓度越高，互补链的碰撞机会越多，复性速率越快 反之，较慢,Sequence complexity and repetition degree,Single-stranded fragments which have a sequence which is repeated in multiple copies in the genome will be able to anneal with many more alternative complementary strands than fragments with a unique se
48、quence, and will hence reassociate more rapidly. highly repetitive sequence structural gene e.g. ATATAT,Experiment process,The re-annealing of the strands may be followed spectroscopically, or more sensitively by separating single-stranded and double-stranded DNA by hydroxyapatile chromatography. Th
49、e fraction of the DNA still in the single-stranded form (f) is plotted against Cot. The resulting curve represents the reassociation kinetics of the DNA sample, and is colloquially known as a Cot curve.,Conclusions,根据这类复性研究，证实重复顺序是真核生物DNA区别于原核生物DNA的一个重要特征。即所有真核生物染色体可能均含重复序列而原核生物一般只含单一序列。 高度和中度重复序列的含量随真核生物物种的不同而变化。,E.coli DNA没有重复顺序。在反应的起始阶段全都是单链，到最后阶段都成为双链，所以E