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1、分离分析法导论 Introduction to Chromatography,色谱法概述,色谱法(Chromatography)溯源 100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色素时采用的实验方法 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法),Tswett色素分离实验,A 一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒 B 将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中 C 随着石油醚提取液向下流过柱子，现出
2、展宽的色带,A B C, 1952年 马丁 (Arcger Martin，1910) 英国人 辛格 (Richard Synge，1914) 英国人，发明分配色谱法, 1938年 R库恩 (Riehard Kuhn，19001967) 德国人，利用Tswett 的方法研究类胡萝卜素和维生素,色谱法与诺贝尔奖的关系,色谱法与诺贝尔奖的关系,效率高。上百种性质类似的化合物可在同一色谱柱上得到分离，复杂样品分析。 速度快。几分钟至几十分钟完成复杂样品的分析。 灵敏度高。直接检测纳克级，预浓缩可达皮克级。 用量少。一次分析只需数纳升至数微升的溶液样品。 选择性好。选择分离模式和检测方法，只分析感兴趣的
3、部分。 同时分析。短时间内可以实现几十种成分的同时分离与定量。 易于自动化。从进样到数据处理的全自动化操作。 定性能力较差。已经发展色谱法与其他分析技术联用。,色谱法特点,色谱法的原理 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂 相(Phase): 物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可
4、分的界面,色谱法原理,色谱法的分类（1）,按流动相的物态分: 气相色谱(Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱(Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂) 按操作形式分: 平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱,色谱法的分类（2）,按分离原理分类: 吸附色谱(Absorption Chromatography) 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 分配色谱(Partition Chromatography) 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 离子交换色谱(Ion E
5、xchangeChromatography) 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC) 体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel PermeationChromatography) 固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC(Gel Filtration Chromatography) 固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液,色谱图及色谱常用术语,色谱图(Chromatogram): 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间,峰高,色谱峰,时间,对羟基苯甲酸甲酯；2. 对羟基苯甲酸
6、乙酯； 3. 对羟基苯甲酸丙酯； 4. 对羟基苯甲酸丁酯,1,2,3,4,基线、色谱峰、峰高,基线是在正常实验操作条件下，没有组分流出，仅有流动相通过检测器时，检测器所产生的响应值。稳定的基线是一条直线，若基线下斜或上斜，称为漂移，基线的上下波动，称为噪音。,漂移,噪音,色谱峰的面积,峰面积,色谱峰的宽度,色谱峰的宽度,死时间t0：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大所需的时间。 保留时间tR：组分从进样到出峰最大之所需的时间。 死体积V0：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的流动相的体积。 保留体积VR：组分从进样到出峰最大之所需的流动相的体积。 调整保留时间tR tR=tR-t
7、0 调整保留体积VR VR=VR-V0 VR=tRF F-流动相流动速度 （ml.min-1),色谱保留值,相对保留值,在相同的操作条件下，一组分相对另一组分的调整保留值之比,相对保留值,相对保留值仅与柱温、固定相性质有关，在同一类色谱柱上具有比较好的重现性，是较好的定性指标。,相对保留值计算,分配平衡,在分配色谱中，组分的色谱行为与其在固定相与流动相之间的分配行为密切相关,组分在两相之间达到分配平衡时，该组分在两相中的浓度之比是一个常数，这一常数称为分配系数，用K 表示。,保留时间与分配系数的关系,分配比,组分在两相中物质的量之比称为分配比:,不能被固定相保留的组分k=0,分配比与保留值的关
8、系,由于分配过程发生在固定相与流动相之间，故分配比可用保留时间或保留体积来表示：,分配比k又称为容量因子、容量比或分配容量,塔板理论,1941年马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板，一个理论塔板的长度称为理论塔板高度H。 经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱内的塔板数相当多
9、，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。,塔板数的计算,塔板理论只考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素，应用受到较大局限。,n 塔板数 Y 色谱峰宽度 L 色谱柱长度 H塔板高度,速率理论-Van Deemter方程,速率理论是荷兰学者范弟姆特于1956年提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范弟姆特方程式）。,H = A + B/u + cu,H：理论塔板高度；u：载气的线速度(cm/s),A涡流扩散项,B/u分子扩散项,c u传质阻力项,H = A + B/u + cu,H = A + B/u + cu, B/u分子扩散项,D为组分
10、在流动相中的扩散系数，单位是cm2s-1。,弯曲因子，填充柱色谱 1，空心毛细管柱则 为1.,H = A + B/u + cu, c u传质阻力项,C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs,Cm为组分从流动相移向固定相时所受到阻力：,Cs组分从固定相移向流动相时所受到阻力：,速率理论的讨论,将涡流扩散项、分子扩散项及传质阻力项分别代入Van Deemter方程，得到,涡流扩散、分子扩散及传质阻力是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响
11、。 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,柱效与流速的关系,载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，随着流速的增加，柱效提高。 载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主要因素，随着流速的提高，柱效下降。,对于气相色谱而言,气相色谱的最佳流速,将H = A + B/u + cu 微分，得,在一定的色谱条件下测得三种不同流速下对应的H值，其中的A、B、C 组成一个三元一次方程组，进而求出A、B、C值，算出H最小和u最佳,色谱分离效能的
12、衡量,分离度,分离度是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据,分离度与柱效能、选择性的关系,分离度方程,n 柱效（塔板数） 2,1 相对保留值，反映固定相对两组分的选择性 k 容量因子（分配比）,分离度,当R大于1.5时，两峰分离的比例达到99.7%，两种组分完全分离。,原始分离状况,分离度与柱效能、选择性的关系,改变n,改变2,1,改变k,色谱定性方法, 与标样对照,利用保留值及相对保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。但该方法不适用于在不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，
13、观察各组分色谱峰的相对变化。,色谱定性方法, 利用保留指数法定性,色谱定性方法,保留指数又称Kovats指数（），是一种重现性较好的定性参数。,测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷 烃的调整保留值之间如图所示：,与其他分析仪器联用的定性方法(结构鉴定) 色谱的分离功能强大，但定性能力不足，并不能完全确证各个组分，特别是新化合物，故将色谱与其他分析仪器联用来获得化合物结构信息，但联用通常涉及较复杂的装置，
14、价格昂贵。 1. 气相色谱-质谱联用仪； 2. 气相色谱-红外光谱联用仪； 3. 液相色谱-质谱联用仪； 4. 液相色谱-核磁共振波谱仪,色谱定性方法,色谱定量分析,校正因子和相对校正因子,定量方法：归一化法,当试样中所有组分全部出峰,组分数与色谱峰数相符时,可以采用该法。计算式如下：,如组分性质相近或对准确度要求不高时，可省略式中的校正因子，此时称面积归一化法。 特点及要求： 归一化法简便、准确。 (2) 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大。 (3) 仅适用于试样中所有组分全出峰且组分数与色谱峰数相符的情况。,内标法原理,内标法 将准确称量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中，根据内标物质量ms与样品质量m以及它们的色谱峰面积求出某一组分含量。如要测定试样中的i组分，其质量为mi,则：,如内标物就是相对校正因子的标准物质，则fs=1,fi/fs=fi,内标法的工作过程,内标法的工作过程,对内标物的要求 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其它色谱峰分离好,内标法,定量方法：外标法,定量方法：外标法,定量方法：外标法与内标法,外标法 在液相色谱中用得最多 内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用得最多,Thank You!,