毕业设计-蒙脱石共固定化淀粉酶和糖化酶的研究.doc

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1、山东科技大学本科毕业设计（论文） 蒙脱石共固定化蒙脱石共固定化淀粉酶和糖化酶的研究 摘要 自20世纪60年代以来,固定化酶技术在食品与发酵工业、有机合成等 领域得到了广泛的应用。而近年来酶的共固定化技术,既有固定化酶的高 稳定性和连续操作能力,又具有酶之间的协同作用，显示出很强的优越性。 本研究选择目前工业上应用比较广泛的蒙脱石为载体,采用吸附法共 固定了-淀粉酶和糖化酶双酶。实验所用的蒙脱石经提纯钠化后，用 KH570对其进行偶联 ，然后用经以上处理的蒙脱石对双酶同时固定 。 并通过测定其活性和酶的吸附率 分析实验结果，确定了共固定化的最 适条件,研究了共固定化酶的性质,为工业应用提供了一定

2、的理论依据。 经本实验所确定的共固定最佳条件为 淀粉酶（U）：糖化酶（U）： 蒙脱石（g）为15：7.5：0.2，pH为5.5，温度为20。在最佳固定条件下 共固定化酶的性质为：最适反应温度为55左右;最适反应pH为5.5；稳定 性在低温下较好，而在高温下不甚理想；共固定化酶在在0下保存10天 后其相对酶活仍在50%以上，使用四次后其相对酶活仍有50%以上，故储藏 性能和操作性能较好。 关键词：共固定化，-淀粉酶，糖化酶。 山东科技大学本科毕业设计（论文） Studies on co-immobilization of -amylase and glucoamylase on montmori

3、llonite Abstract Since the advent of the immobilized enzymes in the 60s of last century, the immobilized enzymes has been widely used in the areas of food and fermentation industry and organic synthesis. The co-immobilized enzymes has both high stability and continuous operation capability and shows

4、 a strong advantage. This study has chosen the montmorillonite which was widely used in todays industrial production as the carrier , and fixed -amylase and glucoamylase dual enzyme system by adsorption . Determined the optimal conditions of co-immobilization and studied the nature of the co-immobil

5、ized enzyme, providing a theoretical basis for industrial applications .The montmorillonite used in this experiment has been purified and Na-treated , and then conjugated by one coupling agent which named KH570 in order to improve its adsorption capacity of the enzymes. Then using the montmorillonit

6、e to fix two-enzyme. Determined the optimal conditions of co-immobilization and studied the nature of the co-immobilized enzyme, providing a theoretical basis for industrial applications . The present study identified a total of constant optimal conditions for amylase (U): glucoamylase (U): montmori

7、llonite (g) as 15:7.5:0.2, pH 5.5, 山东科技大学本科毕业设计（论文） temperature 20 . In the best condition of the fixed nature of immobilized enzyme: optimal temperature was around 55 ; optimal reaction pH 5.5; stability at low temperatures well, but not ideal at high temperatures; The co- immobilized enzyme was st

8、ored at 0 ,after 10 days the relativity was still above 50%, after using four times the relative activity was still more than 50% ,so the co-immobilized enzyme,s storage and operation performance was well. Key words: co-immobilization, -amylase, glucoamylase. 山东科技大学本科毕业设计（论文） 目录目录 1 文献综述文献综述 1 1.1 酶

9、综述.1 1.1.1 酶概述.1 1.1.2 淀粉酶1 1.1.3 糖化酶3 1.1.4 酶的活力 .3 1.1.5 酶活测定4 1.1.6 影响酶活力的因素6 1.2 固定化酶.8 1.2.1 固定化酶概述.8 1.2.2 固定化酶的制备方法9 1.2.3 固定化酶的性质10 1.2.4 食品工业中的应用11 1.2.5 固定化酶的展望12 1.3 共固定化酶.12 1.3.1 共固定化酶概述12 1.3.2 共固定化酶的优点13 1.3.3 共固定化技术的研究与应用13 1.3.4-淀粉酶与糖化酶的共固定方法 .14 1.4 蒙脱石.15 1.4.1 蒙脱石概述15 1.4.2 蒙脱石有机

10、化改性16 2 实验方法实验方法 18 山东科技大学本科毕业设计（论文） 2.1 实验材料与仪器 18 2.1.1 实验材料.18 2.1.2 主要试剂.18 2.1.3 仪器设备.18 2.1.4 主要试剂的配制方法.19 2.2 实验方法实验方法 20 2.2.1 蒙脱石的预处理20 2.2.2-淀粉酶和糖化酶的固定化和处理 .21 2.2.3 还原糖含量的测定21 2.2.4 蛋白质含量的测定22 2.2.5-淀粉酶和糖化酶酶活的测定 .23 2.2.6 共固定化酶固定率的计算24 2.2.7 最佳固定化条件的研究24 2.2.8 共固定化酶性质的研究26 3 结果与分析结果与分析 28

11、 3.1 淀粉酶和糖化酶酶活的测定.28 3.1.1 葡萄糖标准曲线的制作28 3.1.2 酶活的测定29 3.2 淀粉酶和糖化酶酶液蛋白质含量的测定.29 3.2.1 蛋白质标准曲线的制作29 3.2.2-淀粉酶和糖化酶酶液蛋白质含量的测定 .30 3.3 最佳固定化条件的研究.30 3.3.1 双酶最佳比例的研究30 3.3.2 酶与蒙脱石之间比例研究31 3.3.3 最佳固定 pH 的研究.33 山东科技大学本科毕业设计（论文） 3.3.4 最佳固定温度的研究34 3.3.5 小结35 3.4 共固定化酶性质的研究.35 3.4.1 共固定化酶的最适反应温度35 3.4.2 共固定化酶的

12、最适 pH36 3.4.3 共固定化酶的热稳定性37 3.4.4 共固定化酶的储藏稳定性38 3.4.5 共固定化酶的操作稳定性39 3.4.6 小结40 4 总结与建议总结与建议 41 4.1 总结 41 4.2 注意事项 41 参考文献参考文献 43 致谢辞致谢辞 45 附录附录 46 附录 1 英文文献原文 46 附录 2 英文文献译文 60 山东科技大学本科毕业设计（论文） 1 1 文献综述文献综述 1.1酶综述酶综述 1.1.1 酶概述酶概述 酶是一类生物催化剂，其本质为蛋白质，少数为核糖核酸。构成新陈 代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化都是在酶的催化下完成的。 与一般的化学

13、催化剂相比，酶具有很高的催化效率和高度的专一性。但是 由于酶是蛋白质分子，也容易变性和失活1。 1.1.2 淀粉酶淀粉酶 淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是一种可作用于可溶性淀粉、直链淀粉、 糖元等多糖的酶。根据作用的方式可分为 -淀粉酶 （EC3211 ）与 -淀粉酶（EC3212 ） 。 -淀粉酶广泛分布于动物（ 唾液、胰脏等） 、植物（麦芽、山萮菜） 及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并 作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于 支链淀粉，无差别地切 断 -1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应 的消失，最终产物在分解直链淀粉时以

14、 麦芽糖为主，此外，还有麦芽 三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外， 还生成分支部分具有 -1，6-键的 -极限糊精。一般分解限度以 葡萄 糖为准是 35-50，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70分解限 度（最终游离出葡萄糖）。 山东科技大学本科毕业设计（论文） 2 图 1.1-淀粉酶的空间结构 -淀粉酶与 -淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单 位切断 -1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大 豆等） ，但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没 有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或 葡聚糖

15、的时候，切断至 -1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量 比较大的极限糊精。从上述的 -淀粉酶和 -淀粉酶的作用方式，分别提出 -1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（-1，4-glucan4-glucanohydrolase）和 - 1，4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（-1，4-glucanmaltohydrolase）的名称等而被 使用。 淀粉酶是水解淀粉和 糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解 山东科技大学本科毕业设计（论文） 3 织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率 高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉 酶的种类很多，根据织物不同，设备组

16、合不同，工艺流程也不同，目前 所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法 、连续法等。由于淀粉酶 退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有 鲜明的环保特色。 1.1.3 糖化酶糖化酶 糖化酶又称葡萄糖 淀粉酶，糖化酶是一种习惯上的名称 ，学名为 -1，4-葡萄糖水解酶 (-1，4-Glucanglucohydrolace)。本品应用于酒精、 淀粉糖、味精、柠檬酸、 啤酒等工业以及 白酒、黄酒2。 糖化酶是由曲霉优良菌种（ Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。 糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶 Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)。它能把淀粉 从非还原性

17、末端水解 -1.4 葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解- 1.6 葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。 本产品广泛用于生产白酒、黄酒、酒精、啤酒；用于以葡萄糖作 发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大 量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解 的工业上，都可适用。 产品特性： 作用方式：糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原 性末端切开 -1.4 键，也能缓慢切开 -1.6 键。因此，它能很快的把直 链淀粉从非还原性 末端依次切下 葡萄糖单位。 作用条件：本品随作用的温度升高活力增大，超过65又随温度 山东科技大学本科毕业设计（论文） 4 升高而活

18、力急剧下降，本品最适作用温度是60-62。最适作用 pH 值在 4.0-4.5 左右。 1.1.4 酶酶的的活活力力 酶活力单位（U,active unit）： 酶活力单位的量度。 1961 年国际酶学会议规定： 1 个酶活力单位 是指在特定条件（ 25，其它为最适条件）下，在 1min 内能转化 1mol 底物的酶量，或是转化底物中 1mol 的有关基团的酶量。 比活（specific activity）：每分钟每毫克 酶蛋白在 25下转化的 底物的微摩尔数。比活是酶纯度的测量。 活化能（activation energy）：将 1mol 反应底物中所有分子由基态 转化为过度态所需要的能量。

19、 活性部位（active site）：酶中含有底物结合部位和参与催化底物 转化为产物的氨基酸残基部分。活性部位通常位于蛋白质的结构域或 亚基之间的裂隙或是蛋白质表面的凹陷部位，通常都是由在三维空间上 靠得很紧的一些 氨基酸残基组成 3。 1.1.5 酶活测定酶活测定 初速度(initial velocity)：酶促反应最初阶段底物转化为产物的速度， 这一阶段产物的浓度非常低，其逆反应可以忽略不计。 米氏方程（Michaelis-Mentent equation）：表示一个酶促反应的起 始速度（）与底物浓度 (s)关系的速度方程： =maxs/(Km+s) 米氏常数（Michaelis cons

20、tant）：对于一个给定的反应，使酶促反 应的起始速度（ 0）达到最大反应速度（ max）一半时的底物浓度。 催化常数（catalytic number）(Kcat)：也称为转换数。是一个动力 山东科技大学本科毕业设计（论文） 5 学常数，是在底物处于饱和状态下一个酶（或一个酶活性部位）催化一 个反应有多快的测量。 催化常数等于最大反应速度除以总的酶浓度（ max/Etotal） 。或 是每摩酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的量（摩尔） 。 双倒数作图（ double-reciprocal plot）：那称为 Lineweaver_Burk 作图。一个酶促反应的速度的倒数（ 1/V）对底物度的

21、倒数（ 1/LSF） 的作图。x 和 y 轴上的截距分别代表米氏常数和最大反应速度的倒数。 酶活测定方法： 1按反应时间分类法：上世纪 50 年代以前大都使用固定时间法。这 种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。50 年代 中期开始采用连续监测法。这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶 反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但 本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。 （1）定时法（两点法）：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到 t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中 t1往往 取反应开始的时间。酶与底物在

22、一定温度下作用一段固定的时间，通过加 入强酸、强碱、蛋白医学教育网整理沉淀剂等，使反应完全停止（也叫中 止反应法）。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。该法最 基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。优点：简单易行，对试 剂要求不高。缺点：难保证测定结果的真实性。难以确定反应时间段酶促 反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。 （2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应 过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变， 山东科技大学本科毕业设计（论文） 6 通过计算求出酶反应初速度。连续监测法根据连续测得的数据，可选择线 性期

23、的底物或产物变化速率用于计算酶活力。因此连续监测法测定酶活性 比定时法更准确。实际工作中，采用工具酶的酶偶联法已经成为医学、研 究等方面应用最广、最频繁测酶活性的方法。 （3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度 总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。 2按检测方法分类法：分光光度法；旋光法；荧光法；电化 学方法；化学反应法；核素测定法；量热法。 1.1.6 影响酶活力的因素影响酶活力的因素 米契里斯（Michaelis）和门坦（ Menten）根据中间产物学说 推导 出酶促反应速度方程式，即 米-门公式（具体参考 环境工程微生物学 第四章微生物的生理）。由米门公式可知：

24、酶促反应速度受酶浓度和底 物浓度的影响，也受温度、 pH、激活剂和抑制剂的影响。 a酶浓度对酶促反应速度的影响 从米-门公式和酶浓度与酶促反应速度的关系图解可以看出：酶促 反应速度与酶分子的浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多， 底物转化的速度越快。但事实上，当酶浓度很高时，并不保持这种关系， 曲线逐渐趋向平缓。根据分析，这可能是高浓度的底物夹带夹带有许多 的抑制剂所致。 b底物浓度对酶促反应速度的影响 在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促 反应速度与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶 与底物结合生成中间产物后，即使在增加底物浓度，中间产物浓度也

25、不 山东科技大学本科毕业设计（论文） 7 会增加，酶促反应速度也不增加。 还可以得出，在底物浓度相同条件下，酶促反应速度与酶的初始浓 度成正比。酶的初始浓度大，其酶促反应速度就大。 在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应 速度并没有因此增加，甚至受到抑制。其原因是：高浓度底物降低了水 的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。过量的底 物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而 也会降低反应速度。 c温度对酶促反应速度的影响 各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适 宜的温度范围内，温度每升高 10，酶促反应速度可以相应提高

26、 12 倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的 最适温度为 3740；微生物体内各种酶的最适温度为2560， 但也有例外，如黑曲糖化酶的最适温度为6264；巨大芽孢杆菌、 短乳酸杆菌、 产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为 80；枯 草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为8594。可见，一些芽孢杆菌 的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降 低酶促反应速度。 最适温度在 60以下的酶，当温度达到 6080时，大部分酶 被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100时，酶的催化作用完全 丧失。 dpH 对酶促反应速度的影响 酶在最适 pH 范围内表现出活性，大于或

27、小于最适pH，都会降低 山东科技大学本科毕业设计（论文） 8 酶活性。主要表现在两个方面： 改变底物分子和酶分子的带电状态， 从而影响酶和底物的结合； 过高或过低的 pH 都会影响酶的稳定性， 进而使酶遭受不可逆破坏。 e激活剂对酶促反应速度的影响 能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂种类很多，有无机阳 离子，如钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等； 无机阴离子，如氯 离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离子磷酸盐离子等；有机化合物 ， 如维生素 C、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。许多酶只有当某一种适当 的激活剂存在时，才表现出催化活性或强化其催化活性，这称为对酶的 激活作用。而有些酶被合成后呈现无活性状态

28、，这种酶称为酶原。它必 须经过适当的激活剂激活后才具活性。 f抑制剂对酶促反应速度的影响 能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。它可降低酶 促反应速度。酶的抑制剂有重 金属离子、一氧化碳、硫化氢、氢氰酸、 氟化物、碘化乙酸、 生物碱、染料、对 -氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、 乙二胺四乙酸、表面活性剂等。 对酶促反应的抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。与底物结构 类似的物质争先与 酶的活性中心 结合，从而降低酶促反应速度，这种 作用称为竞争性抑制。竞争性抑制是可逆性抑制，通过增加底物浓度最 终可解除抑制，恢复酶的活性。与底物结构类似的物质称为竞争性抑制 剂。抑制剂与 酶活性中心以外的

29、位点结合后，底物仍可与酶活性中心 结合，但酶不显示活性，这种作用称为非竞争性抑制。非竞争性抑制是 不可逆的，增加底物浓度并不能解除对酶活性的抑制。与酶活性中心以 山东科技大学本科毕业设计（论文） 9 外的位点结合的抑制剂，称为非竞争性抑制剂。有的物质既可作为一种 酶的抑制剂，又可作为另一种酶的激活剂。 1.2固定化酶固定化酶 1.2.1 固定化固定化酶概述酶概述 酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能 进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶的固定化技 术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相 比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反

30、复使用、成本低廉等优点， 在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础 研究等方面发挥了重要作用。因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注 目的领域4。 1.2.2 固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法 制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交 联法等。 a包埋法：将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法 称为包埋法。 包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包 埋法。凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成 一定形状的固定化酶的方法。最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、 卡拉胶、聚丙烯酰胺等。微胶囊包埋法是将

31、酶包埋在高分子半透膜中，制 成微胶囊固定化酶的方法。常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。 b吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使 酶固定化的方法称为吸附法。吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅 藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。 山东科技大学本科毕业设计（论文） 10 吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活， 载体价廉易得，而且可反复使用。但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱， 酶与载体结合不太牢固而易脱落。 c共价键结合法法：利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上 的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。 这种方

32、法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。缺点是制备 过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。共价偶联法常用 的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。 d交联法：交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相 载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。常用的双功能试剂有戊二 醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。但由于交联反应较 激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大。实际使用时，往往与 其他固定化方法联用，如将酶先经凝胶包埋后，再经交联等。这种采用两 个或多个方法进行固定化的技术，称为双重或多重

33、固定化法，用此法可制 备出酶活性高、机械强度好的固定化酶。 表 1.1 各种固定化方法比较5 1.2.3 固定化酶的性质固定化酶的性质 山东科技大学本科毕业设计（论文） 11 酶经固定化以后，由于受到载体等因素的影响，其特征可能会发生某 些改变。为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游 离酶之间的差别，并对操作条件加以适当调整。 a稳定性：固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现 在对热、蛋白酶、各种变性剂的耐受性增强，使用和保存的稳定性提高。 b最适温度：固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化 能也变化不大。但也有些固定化酶的最适温度与游离酶比较有明显的差别。

34、 例如，氨基酸酰化酶最适温度一般在 60 左右，用 DEAE-纤维素固定化 后，其最适温度高达 72 。 c最适 pH：酶经固定化后，其最适 pH 往往会发生变化，这一点在 使用时必须引起注意。影响固定化酶最适 pH 因素主要有两个：一个是载 体的带电性质；另一个是酶催化反应的产物性质。 载体的带电性质对固定化酶的最适 pH 也有明显的影响。一般说来， 带负电的载体制备固定化酶，其最适 pH 比游离酶高；而带正电的载体制 备的固定化酶其最适 pH 比游离酶低；而用电中性的载体制备的固定化酶， 其最适 pH 一般不改变。 酶催化反应的产物性质对固定化酶的最适 pH 也有一定的影响。一般 来说，产

35、物为酸性时固定化酶的最适 pH 比游离酶高一些；产物为碱性时， 固定化酶的最适 pH 比游离酶低一些，产物为中性时，最适 pH 一般不改 变。 d底物特异性：固定化酶的底物特异性与游离酶比较有所不同。比 如对一些可作用于大分子底物，也可作用于小分子底物的酶而言，经固定 化后，由于受到载体空间位阻作用的影响，大分子底物难于接近酶分子， 而使其催化反应速度大大降低，而小分子底物的反应速度则不受影响5。 1.2.4 食品工业中的应用食品工业中的应用 山东科技大学本科毕业设计（论文） 12 自 1953 年 NGrubhofer 用共价偶联法，在载体聚氨基聚苯乙烯树脂 上连接了淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶

36、与核糖核酸酶，获得首批固定化酶之 后，经多年实线，运用各种各样的方法，现已制备出数百种固定化酶。如 生产中使用规模最大的固定化酶是在 DEAE葡聚糖凝胶上固定的氨基酸 酰化酶。该酶水解 N酰基L氨基酸中的酰胺键，对于 N酰基D氨基 酸无作用，故可用来拆分 DL氨基酸，制备 L氨基酸。 在食品工业中，可把固定化的 -淀粉酶与葡萄糖淀粉酶混合装柱，糊 化的淀粉溶液流经此柱后，淀粉便水解为葡萄糖，这是近几年提出的酶法 制葡萄糖的一条新途径。近几年来，不少地方采用过氧化氢对牛奶灭菌， 为了除去牛奶中过量的过氧化氢，可用固定化的过氧化氢酶使之分解。此 外，还有人介绍固定化的葡萄糖氧化酶清除蛋清中微量的葡

37、萄糖，以防制 成的蛋白干片在贮存中发生褐变6。 固定化酶在食品工业上还有以下几方面的应用：如用固定化果胶酶澄 清果汁；用固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒；用固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖 转变为果糖等。一旦固定化酶大规模用于食品工业，必将有助于更经济更 有效地生产高质量的食品。 1.2.5 固定化酶的展望固定化酶的展望 目前，酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。研究探索新的酶 固定化技术、提高固定化酶活性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定 化酶研究领域的主要研究内容。随着固定化酶研究的深入，必将在微生物 发酵、酶工程、精细化工、环境保护、制药、生物传感器等领域，尤其是 在大规模生物转化、手性化合物的

38、合成以及其他传统酶和蛋白质等方面得 到更广泛的应用7。 山东科技大学本科毕业设计（论文） 13 1.3共固定化酶共固定化酶 1.3.1 共固定化酶概述共固定化酶概述 自20世纪60年代固定化酶技术问世以来，在食品与发酵工业、有机合 成等领域得到了广泛的应用，并显示出很强的优越性。近年来在单一酶固 定化技术逐渐成熟的基础上又建立了多酶共固定化技术，从而实现了固定 化多酶体系的共固定和共反应。这种系统稳定，可将几种不同功能的酶， 细胞和细胞器在同一系统内进行协同作用。共固定化的优点共固定化能使 各组分之间互补催化活性，可以平衡两个不同细胞或酶之间相应的酶活性 获得高产率或用该系统处理某种成分，或得

39、到某种有效成分。多酶共固定 化技术的研究始于1970年Mos-bach建立的固定化多酶体系，既拥有固定化 酶的高稳定性和连续操作能力，具有双酶的协同作用。1985年日本学者在 研究中指出：混合的可溶性-淀粉酶与糖化酶作用于淀粉糊，解过程中具 有协同效应8。 1.3.2 共固定化酶的优点共固定化酶的优点 共固定化的优点共固定化能使各组分之间互补催化活性,可以平衡两 个不同细胞或酶之间相应的酶活性获得高产率或用该系统处理某种成分, 或得到某种有效成分。混合发酵往往采用生长条件相近的菌种,差异性较 大则很难实现同步生长，共固定化技术可以避开这一矛盾,先将菌种各自 培养,然后再进行共固定。 1.3.3

40、 共固定化技术的研究与应用共固定化技术的研究与应用 多酶系统的共固定化是一个引人注目的研究动向，它是将二种或多种 有联系的酶同时进行固定化，以形成多功能的生物催化剂，达到比单一酶 更复杂的转化。淀粉酶与糖化酶共固定化，葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶共 山东科技大学本科毕业设计（论文） 14 固定化，黄素氧化酶与过氧化氢酶及超氧化物歧化酶共固定化，腺营酸激 酶与乙酸激酶共固定化等都是人们进行多酶共固定化的例子。在 20 世纪 八十年代初至九十年代初，多酶的共固定化研究仅仅处于初始探索阶段。 1982 年 Ku 将工业应用的两种催化淀粉水解的酶，即普鲁兰酶和糖化酶共 固定在胶原蛋白膜上。在单独固定普鲁兰

41、酶后稳定性并不增加，但与糖化 酶共 固定之后稳定性增加一倍，并且反应体系内的 DE 值增加了 5%-10%。 Srerez 等人将苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶和乳酸脱氢酶共固定在载体聚 丙稀酞胺凝胶上，发现其产生柠檬酸的速度可达溶液中三酶系统的 400%。 1983 年 Alxeander 将 -淀粉酶和糖化酶共固定在微孔塑料膜上，催化淀粉 产生麦芽糖。Mattasiosnz 把三种酶半乳糖昔酶、己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶共固定在载体上，发现三酶共反应比双酶共反应的协同优势更加明 显。1990 年，Storye 等人共固定纤维素酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶， 由纤维一步生产果糖。在反应

42、达到平衡时，葡萄糖和果糖的比例为 70:30。1992 年 Schahfuaesr 和 Storye 把糖化酶、普鲁兰酶和葡萄糖异构酶 共固定在骨头上，用一部法由糖元生产果糖，结果得到 20%的果葡糖浆。 而进入二十一世纪，多酶共固定技术已逐渐引起了国内外酶工程专家的极 大兴趣，并处于迅速发展阶段，其研究报道也是络绎不绝9。 1.3.4-淀粉酶与糖化酶的共固定方法淀粉酶与糖化酶的共固定方法 目前关于-淀粉酶与糖化酶的固定方法研究目前比较成熟。已发表 论文中对其固定方法主要有： （1）吸附法：目前为止最为常用的方法。常用的载体有活性炭，黏 山东科技大学本科毕业设计（论文） 15 土硅藻土，离子交

43、换海绵，多空玻璃等。该方法操作简单，对酶活力影响 较小，但吸附效率较低。 郭桥等以纤维素为载体用重氮化法共固定-淀粉酶与糖化酶10。该 载体的制备操作如下：将滤纸纤维素用3mol/LNaOH浸泡过夜，然后水洗， 打浆，得到较均一的纤维素。将10鲍湿纤维素悬浮于150mLlmol/LNa0H溶 液中，加入60mL环氧氯丙烷，于60反应30min，过滤，水洗后，再加入 209对苯二胺水溶液，于45反应3Omin，抽干，水洗后即得胺化纤维素。 共固定化酶的制备：载体的活化方法采用重氮法。将载体加入水3.0mL， 然后再加入 lmol/LHCl 5:OmL搅拌均匀。在O-5度下慢慢滴加5.0mL5%的

44、NaNO2溶液。 20min后抽干。先用冷的0.O05mol/LHCl洗三次，再用水洗三次后抽干。在 一定条件下，加入适量比例的a-淀粉酶与糖化酶，在0-5度条件下反应 0.5-4h后依次用水、3mol/LNaCl、水各洗三次，即得共固定化酶。 （2）包埋法：常用的包埋法载体有天然高分子凝胶和有机合成高分 子凝胶，如聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，壳聚糖，海藻酸钠等。 顾旭炯等在海藻酸钠包埋法共固定-淀粉酶和糖化酶的研究中对 此方法做了比较详细的研究11。该研究的具体方法为，双酶体系的共固定 化：称取一定量的海藻酸钠固体在沸水浴中搅拌溶解，待冷却到一定温度 后，加入到一定比例一定pH值的双酶混合液中，使

45、海藻酸钠最终达到一定 的浓度，待充分搅拌均匀后，滴入至一定浓度的CaCl2溶液中，形成直径为 2-3 mm的海藻酸钙凝胶珠，于5下静置固化10 h左右，取出用真空泵抽 干，测其反应速率。改变海藻酸钠、氯化钙和酶的浓度使固定化效果达到 最佳。酶反应速率的测定：取20 mL质量体积比为2%的可溶性淀粉溶液放 山东科技大学本科毕业设计（论文） 16 入试管中，加入缓冲液5 mL，放入水浴中预热5 min，然后取一定量的固 定化酶加入溶液中，反应5 min后，加入1 molL-1的NaOH 5 mL，再在沸 水浴中加热5min灭活。取一定量离心后用DNS比色定糖法测定还原糖含量， 进而计算反应速率。蛋

46、白质含量的测定：采用考马斯亮蓝G-250染色法， 以牛血清白蛋白为标准蛋白进行测定。 1.4蒙脱石蒙脱石 1.4.1 蒙脱石概述蒙脱石概述 蒙脱石是由颗粒极细的含水铝硅酸盐构成的矿物，它们一般为块状或 土状。蒙脱石晶体属单斜晶系的含水层状结构硅酸盐矿物。名称来源于首 先发现的产地法国的 Montmorillon。蒙脱石颗粒细小，约 0.21 微米，具 胶体分散特性，通常都呈块状或土状集合体产出。蒙脱石在电子显微镜下 可见到片状的晶体，颜色或白灰，或浅蓝或浅红色。当温度达到 100200时，蒙脱石中的水分子会逐渐跑掉。失水后的蒙脱石还可以重 新吸收水分子或其他极性分子。当它们吸收水分后还可以膨胀

47、并超过原体 积的几倍。蒙脱石的用途多种多样，人们将它的特性运用到化学反应中以 产生吸附作用和净化作用。它还可以作为造纸、橡胶、化妆品的填充剂， 石油脱色和石油裂化催化剂的原料等，还可作为地质钻探用泥浆，冶金用 粘合剂及医药等等方面。 1.4.2 蒙脱石有机化改性蒙脱石有机化改性 由于蒙脱石晶层内部为双电层结构，表面层所带的负电荷更易吸附截 面积大的有机阳离子到晶层附近，最终取代层间原有阳离子，形成新的更 加稳定的复合层状结构，改性为有机蒙脱石。从所用有机阳离子结构看， 可分为非反应型和反应型两大类14。 山东科技大学本科毕业设计（论文） 17 非反应型有机蒙脱石非反应型有机蒙脱石是应用较早的蒙

48、脱石有机化 改性产品，已广泛应用于油漆、油墨和润滑脂等产品中。凡自身在溶液中 能电离出有机阳离子(如季胺盐)或通过质子化加 H+能生成有机阳离子(如伯 胺 RNH2、仲胺 R2NH、叔胺 R3N)等均可作为非反应型有机蒙脱石改性剂, 所用有机物中的 R 基主要为饱和烷基,本身仅起离子交换、偶联和撑大层 间距的作用。非反应型有机蒙脱石由于有机物结构上的局限，主要利用其 在有机相中的分散和偶联作用，当蒙脱石层间有机阳离子交换达到一定程 度后，使片层边沿端带正电,端电荷能同片层表面的负电荷形成以“Z”字 型搭接相连的结构，从而使有机蒙脱石在有机相中表现出较好的凝胶和触 变性能，可用于涂料增稠剂、流平

49、剂和聚合物增强剂等许多领域。 反应型有机蒙脱石反应型有机蒙脱石所用有机物除要求能生成阳离子 外，还要求阳离子本身带有活性基团或不饱和键，通过引发剂或体系热作 用时，活性基团间能反应脱水缩聚或同基体混合反应缩聚，或不饱和键打 开相连形成稳定的交联高分子。此类蒙脱石改性剂常用的有烷基氨基酸、 烷基内酰胺、烷基二胺、烷基醇胺及含有不饱和双键(或三键)等的有机化 合物。改性加工后的反应型有机蒙脱石常用于不同基体树脂的复合材料合 成中。蒙脱石所带的有机基团由于反应时的热作用和生成大分子产物的结 构效应,使蒙脱石的片层更易分散，甚至解离成以单元片层为主的完全剥离 型分散的有机蒙脱石。 1.5 本课题的目的和意义本课题的目的和意义 本课题的目的是在为工业上淀粉一步水解为葡萄糖的生产提供一个可 靠的技术支持和理论依据。选取现在工业上比较常用，价格相对较低廉蒙 脱石为载体共固定化一淀粉酶和糖化酶，并确定其最佳固定化条件，研 山东科技大学本科毕业设计（论文