COX-2蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义.pdf

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1、 1 主要缩略语英文索引 英文缩写 英文全称 中文对照 COX cyclooxygenase 环氧合酶 NPC nasopharyngeal carcinoma 鼻咽癌 IHC immunohistochemistry 免疫组织化学 WB western bloting 蛋白印迹 SPSS statistical package of social scicece 社会科学统计软件包 HE hemotoxylin and eosin staining 苏木素-伊红染色 S-P streptavidin-peroxdase 链霉菌抗生物素蛋白-过氧 化物酶 DAB diaminobenzidin

2、e 二氨基联苯胺 EDTA ethylene diamine tetra-aceticacid 乙二胺四乙酸 2 COX-2 蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义 中 文 摘 要 目 的目 的 ：研 究 鼻 咽 癌 (nasopharyngeal carcinoma,NPC) 组 织 中 环 氧 合 酶 -2(cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白的表达情况，评价 COX-2 蛋白表达水平与 NPC 临床病理参数的关系， 探讨 COX-2 蛋白对于 NPC 发生发展情况的预测价值及其 临床意义。 方法：方法：分别用免疫组织化学方法(immunohistochemistry,IHC)及蛋

3、白印迹方法 (western blot)检测组织中 COX-2 蛋白的表达情况， 并进行分析。 收集鼻咽癌患者 47 例，全部经病理检测证实，其中用于免疫组织化学检测的鼻咽癌蜡块组织 33 例，用于蛋白印迹方法检测的新鲜活检鼻咽癌组织 14 例；另外收集同期鼻咽炎 患者 24 例作为对照组，亦全部经病理检测证实，用于免疫组织化学检测及蛋白 印迹方法检测的各 12 例。 结果：结果：免疫组织化学方法结果显示 COX-2 蛋白在鼻咽癌组织的阳性表达率为 81.8%（27/33） ，在鼻咽炎组织的阳性表达率为 25%（3/12） ，两者表达差异有统 计学意义（P=0.001） 。蛋白印迹方法结果显示

4、，在两种组织中 COX-2 蛋白表达的 相对值分别为 1.2580.034 和 0.4870.076，在鼻咽癌组表达显著增高 （P=0.000） 。 结论：结论：COX-2 蛋白在鼻咽癌组织中高度表达，与鼻咽癌的转移相关，有可能作 为判断鼻咽癌生物学行为、转移潜能的指标。 关键词：关键词：COX-2 蛋白；鼻咽癌；免疫组织化学；蛋白印迹 3 Expression and clinic significance of cox-2 protein in nasopharyngeal carcinoma Abstract Objective:To study the expression of cy

5、clooxygenase-2 protein in nasopharyngeal carcinoma, evaluate the relevance between the level of cyclooxygenase-2 protein expression with the clinic pathology parametric in nasopharyngeal carcinoma. Investigate its predicting value and clinic significance for the development situation on nasopharynge

6、al carcinoma. Methods: The immunohistochemistry method and Western blot method were used to determine the expression of COX-2 protein in all specimens. the consequence analyzed.47 cases of nasopharyngeal carcinoma patients were collected, which confirmed by biopsy. Of the total 33 cases by IHC and 1

7、4 cases by Western Blot. At the same time, 24 nasopharyngitis tissues were detected also rolled in as the control. Among the total 12 cases by IHC and 12 cases by Western Blot. Results:Positive staining rate of COX-2 in specimen of nasopharyngeal carcinoma (81.8%) was significantly higher than that

8、of nasopharyngitis tissues (25%)( P = 0.001). Western Blot assay revealed that relative COX-2 protein level was 1.258 0.034 and 0.487 0.076 respectively in the two tissues,which was significantly higher in nasopharyngeal carcinoma(P=0.000). Conclusions: The expression of COX-2 is enhanced in NPC,whi

9、ch correlated with metastasis of NPC, and it may become a mark of judgement on its biological behaviour and metabasis potentiality. 4 Key words:Cox-2 protein;Nasopharyngeal carcinoma;Immunohistochemistry; Western blot Qiancheng JING(Otorhinolaryngology) Directed by Prof. Zhiqiang LUO 5 前 言 鼻咽癌在世界各大洲

10、均有发现，有明显的种族易感性、地区聚集性和家族倾 向性，与EB病毒（EBV）感染、遗传、饮食习惯及环境因素密切相关 1。其中全 球80%的NPC发生在中国南方和东南亚地区，是我国最常见的头颈部恶性肿瘤之 一，约占头颈部恶性肿瘤的80%，素有“广东瘤”之称，其也是世界上唯一被冠 以地名的恶性肿瘤。 国内鼻咽癌分布以广东肇庆、 佛山及广西梧州等为高发中心， 发病率由南到北逐渐降低。中国南方五省（广东、广西、福建、湖南、江西）年 发病率可达1025/10万，男女之比为23：1，儿童少见，3060岁为发病高峰 期。 由于鼻咽部解剖结构复杂，鼻咽癌发病部位隐蔽，早期缺乏特异性症状，多 数患者难以早发现、

11、早治疗。我国鼻咽癌的组织学类型主要为非角化型，又以低 分化型鳞癌多见，易出现颈部淋巴结及远处转移，在初诊的患者中，、期鼻 咽癌约占总病例的 70%左右。由于非角化癌对放射线敏感，因此放射治疗一直是 其首选的标准治疗方法，但单纯放射治疗鼻咽癌的 5 年生存率仅 70%左右，而晚 期鼻咽癌（、）的 5 年生存率更低，约 10%-25%。不同的鼻咽癌患者在病理 类型、肿瘤分化程度、就诊时病变严重程度、临床表现、体质状况、对放化疗敏 感性方面都存在着不同程度的差异。 近年来，随着诊疗技术的提高，鼻咽癌的诊断和治疗有了很大的进展，五年 生存率明显提高。但对于早期诊断、临床分期、疗效判断和预后预测等方面仍

12、不 够理想，因此，寻找与鼻咽癌早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现鼻 咽癌的早期诊断、进展监测以及个体化治疗具有重要意义。 环氧合酶（Cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸合成前列腺素的一个限速 酶，可将花生四烯酸转变为各种前列腺素产物，维持机体的各种病理生理过程。 目前发现哺乳动物 COX 至少有两种同工酶,即 COX-1 和 COX-2，两者虽有 61 % 的同源性，但它们在表达调控、定位分布和功能上明显不同 2。人 COX-1 编码 的蛋白在大多数组织和细胞中稳定表达， 被称为 “管家基因(home keepinggene)” ， 属结构型表达蛋白，有多种生理功能，如保

13、护胃黏膜、维持肾血流、促进血小板 聚集等。而 COX-2 为诱导性表达，静息时并不表达，在大多数正常组织难以发 现，一般只在受刺激时迅速合成，这种刺激因子可为细胞因子、生长因子、促癌 6 剂以及癌基因产物等，被称为“快反应基因” 3。 近年研究表明,诱导型COX-2在多种恶性肿瘤中有较高表达，在肿瘤的发生 及发展等多个环节发挥重要作用。 COX-2可促进细胞增殖 4、 抑制肿瘤细胞凋亡、 促进肿瘤新生血管形成 5 、抑制机体的免疫反应6、增加转移潜能、抑制DNA 修复及可能是联系炎症与癌变的重要因素之一 7-8。在结肠癌、直肠癌、胃癌、 肺癌、食管癌、前列腺癌、喉癌等组织中均检测到COX-2的

14、高表达 ,但有关鼻咽 癌组织中COX-2表达情况的报道甚少,且结果不一。既往研究表明，在鼻咽癌 COX-2及其mRNA的表达上调，表达阳性率为61.67%90%。Peng JP 9等研究发 现鼻咽癌组织中COX-2的阳性表达率显著高于鼻咽部黏膜组织，并发现其在 N1-N3组与N0组差异有显著性（P=0.006） ，与淋巴结转移与否亦有关。 除COX-2在促进鼻咽癌发生发展外， 尚发现选择性COX-2抑制剂不仅对机体 免疫监视、肿瘤血管形成及细胞增殖有影响，它还有在一定氧化压力下表现出抗 诱变效应。另外，COX-2抑制剂可以提高肿瘤组织对放疗的敏感性，可能是由于 其能抑制因放疗而损伤的肿瘤DNA

15、重新修复，这在Raju U等 10的实验中得到了验 证。COX-2抑制剂对鼻咽癌的作用机制尚不十分清楚，众多实验研究表明，抑制 剂竞争性与COX-2结合，抑制其作用于底物，从而减少前列腺素的合成，进一步 抑制肿瘤细胞的分裂，促进细胞凋亡，抑制肿瘤的血管生成，减少自由基分子产 生， 降低突变的可能性， 增强机体的免疫力 11， 从而达到防治肿瘤的目的。 总之， 无论是独立应用还是作为放疗的辅助治疗或与其它抗癌药合用， COX-2抑制剂将 为鼻咽癌的预防和治疗提供新的靶点。 本研究分别用免疫组织化学方法及蛋白印迹方法检测鼻咽癌组织及鼻咽炎 组织中 COX-2 蛋白的表达情况，并进行分析比较，探讨

16、COX-2 在鼻咽癌的发生 发展及预后方面所起的作用及可能的作用机制。 7 一、实 验 材 料 1.1 资料收集 标本取自 2007 年 10 月至 2008 年 9 月就诊于我院并活检的鼻咽癌组织，标 本均经病理学确诊。患者入院前均未接受过非甾体类抗炎药物治疗及放、化疗， 对照组取同期确诊的鼻咽部炎症组织。患者均签署知情同意书。用于免疫组织化 学方法检测的实验组共 33 例，其中男 25 例，女 8 例，2970 岁，平均 49.8 岁； 组织学类型高、中分化鳞癌 2 例，低分化鳞癌 31 例；按 2002UICC 鼻咽癌分级标 准，T1-2 级 15 例，T3-4 级 18 例；根据有无淋

17、巴结转移分为转移组 20 例，未转 移组 13 例。对照组共 12 例，其中男 7 例，女 5 例，2162 岁，平均 45.8 岁。 用于蛋白印迹方法检测的实验组共 14 例，其中男 9 例，女 5 例，年龄 2974 岁，平均 52.0 岁；组织学类型高、中分化鳞癌 2 例，低分化鳞癌 12 例；对照组 共 12 例，其中男 8 例，女 4 例，年龄 2372 岁，平均 47.5 岁。 1.2 受试对象纳入标准 1.2.1 标本均经病理学检查确诊。 1.2.2 患者的相关资料完整，包括姓名，性别，年龄，地址，联系方式，病案 号，主诉，现病史，体格检查，特殊检查、病理分级、T分期等。 1.3

18、 主要实验设备、仪器（见表一） 8 表一、试验所用设备、仪器 设备名称 规格型号 生产厂家 高速冷冻离心机 5417R 德国eppendorf公司 酸度计 PP15 德国 数码摄影显微镜 BX-51 日本奥林巴斯 微量紫外分光光度计 LAMBDA25 美国PE公司 台式高速离心机 5810 德国基因公司 二维电泳系统 EITNDALTSIX 美国安玛西亚公司 Finnpipette 定量可调式移液器 广州雷得生物技术有限公司 制冰机 雪花型70KG 多功能电转移仪 03061800 德国eppendorf公司 超速冷冻离心机 CP100MX 日本日立公司 低温恒温水浴箱 782302 丹麦He

19、to 纯水器 MAIMA 英国Eiga 连续变倍体视显微镜 SMZ-1500 日本尼康公司 冷藏冰箱 TS-92 河南新飞电器有限公司 双蒸水机 SZ-93 上海亚荣生化仪器厂 70冰箱产品 ULTRA-LOW 日本三洋公司 去离子水制备机 德国ELGA公司产品 电子天平 BL-220H 日本Shzmadzu公司 摇床 TS-92 金坛市恒丰仪器厂 烤箱 上海跃进医疗器械厂 1.4 主要实验试剂 1）兔抗人环氧化酶 2 免疫组化单克隆抗体：编号 RMA-0549，购于福州迈新生物 技术有限公司，4避光保存于冰箱中，无需稀释型。 2）辣根酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)，编号 ZB-2301，购

20、于北京中杉金桥生物技术 有限公司，-20冰箱保存。 3）即用型快速免疫组化 maxvision TM试剂盒：编号 KIT5004，购于福州迈新生物 技术有限公司。 9 4）DAB 显色试剂盒：编号 DAB-0031/1031，购于福州迈新生物技术有限公司。使 用时临时配置，30 分钟内有效。 5） 苏木素体细胞快速染色液： 编号 CTS-1099， 购于福州迈新生物技术有限公司。 6）PBS 缓冲液（PH7.2-7.4） ：定容双蒸馏水 1000ml，称量 Nacl8.0g， Kcl0.20g,NaHPO4 3.748g，KHPO40.2g，加入双蒸馏水中充分溶解并混匀。 7）柠檬酸盐缓冲液（

21、PH6.0） ：定容双蒸馏水 1000ml，称量柠檬酸三钠 3g，柠檬 酸 0.4g 加入双蒸馏水中充分溶解并混匀。 8）中性树脂：购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 9) 兔抗人环氧化酶 2 蛋白印记多克隆抗体，购于 SANTA CRUZ 公司。 10) BCA 法蛋白定量试剂盒：货号 GK5011，上海捷瑞生物工程有限公司。 11）通用蛋白裂解/抽提试剂盒：编号 P0027，碧云天生物技术研究所。 12）SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5） ：编号 P0015，碧云天生物技术研究所。 13）SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒：编号 P0012A，碧云天生物技术研究所。 14）蛋白分子量标准

22、：编号 P0062，碧云天生物技术研究所。 15）5电泳缓冲液：定容去离子水 1000ml,称量 Tris 15.1g,甘氨酸 94g， SDS 5g 依次加入去离子水中并完全溶解，充分混匀。 16）转膜缓冲液：定容去离子水 800ml，依次称量 Tris 5.8g,甘氨酸 2.9g，SDS 0.37g 依次加入去离子水中充分溶解并混匀,加入甲醇 200ml 定容至 1000ml。 17）5TBST 的配制（0.05mol/L） ：定容 1000 ml 双蒸水，称量 Tris 12.1g，NaCl 40g 加入双蒸水中充分溶解并混匀，浓盐酸调节 pH 值至 7.6，常温保存。临用前 配成 1T

23、BS1000ml，加入 0.5 ml Tween-20。 18）封闭液：1TBS30ml 中加入脱脂奶粉 1.5g。4冰箱保存可使用一周。超过 一周重新配制。 19) Western 一抗二抗去除液：编号 P0025，碧云天生物技术研究所。 20）Actin 抗体：编号 AA128，碧云天生物技术研究所。 21）PVDF 膜：上海捷瑞生物工程有限公司。 22）BeyoECL Plus(超敏 ECL 化学发光试剂盒)：编号 P0018 ，碧云天生物技术 研究所。 23) 显影定影试剂盒：编号 P0019, 碧云天生物技术研究所。 10 二、实验方法及步骤 1、免疫组织化学染色(IHC)步骤： 切

24、片：切片机调制厚度为 4 微米，所切标本贴片于经多聚赖氨酸处理过的玻片 上， 60烤片 20 分钟备用。 脱蜡：二甲苯脱蜡 2 次，每缸 10 分钟。 水化：100%，95%，80%的梯度酒精各一缸，依次进行水化，每缸 5 分钟。 冲洗：自来水冲洗 5 分钟，PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3 分钟。 抗原修复：用枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）行煮沸热修复，持续 10 分钟。 冲洗：PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3 分钟。 封闭：每张玻片用 3%双氧水 1 滴（约 50 微升）室温封闭 10 分钟。 冲洗：PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3 分钟。 一抗孵育：每张玻片滴加兔抗人环氧化酶

25、2 免疫组化单克隆抗体 1 滴（约 50 微升） ，置于 4冰箱过夜。 冲洗：次日取出玻片后复温至室温，PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3 分钟。 二抗孵育：滤纸印干残留的 PBS 缓冲液，每张玻片滴加即用型 Maxvision TM 试剂（即二抗） ，室温孵育 15 分钟。 冲洗：PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3 分钟。 显色：每张切片滴加新鲜配制（按说明书配制、使用）的 DAB 显色液 100ul， 显微镜下观察染色深度（见到棕黄色颗粒或 10 分钟无显色即用 PBS 缓冲液冲洗 10 分钟） 。 复染：苏木素复染 1 分钟，自来水冲洗 3 分钟。 分化：1%盐酸酒精分化 20 秒，

26、自来水冲洗 10 分钟。 脱水：75%，85%，95%，100%的梯度酒精各一缸，依次进行脱水，每缸 5 分钟。 11 透明：二甲苯 2 缸行透明，每缸 3 分钟，取出后风干。 封片：中性树胶封片，加盖玻片后 60烘烤 30 分钟。 镜检：观察结果并在显微镜下拍照。 12 免疫组织化学染色结果判定标准： 染色结果以细胞浆染色出现特异性棕黄色片状或颗粒状者为阳性细胞。 每张 切片在高倍显微镜下随机选择 5 个视野，计算每个视野 COX-2 阳性细胞率，取平 均值作为该标本的阳性细胞率。COX-2 表达结果分为阴性（-） ：切片中无阳性细 胞；弱阳性（+） ：切片中阳性细胞率小于 50%；阳性（+

27、） ：切片中阳性细胞率 大于 50%，小于 75%；强阳性（+） ：切片中阳性细胞率大于 75%。 13 2、蛋白印记（Western blot）检测步骤: 标本组织称量： 新鲜活检标本组织从-80冰箱中取出于室温下解冻，电子天平称取每份标 本约 50-100mg。 匀浆：将组织标本剪碎后放入研磨管中，按说明书加入组织裂解液，将组织研 磨成泥状，研磨于冰上进行，快速匀浆。 离心：将研磨后的悬液混合物置于 EP 管中，12000 转 4离心 5 分钟。 定量：离心后取上清液 10 微升行蛋白定量，按 BCA 蛋白定量试剂盒说明书操 作，将蛋白上清液加入 96 孔板中，用酶标仪定量。提取的剩余上清

28、液置于-80 冰箱中分装冻存并编号备用。 配制电泳胶：浓缩胶与分离胶（见表 2） 表 2、浓缩胶与分离胶的配制 10%分离胶（10ml） 5%浓缩胶（5ml） 去离子水(ml) 3.94 4.13 Acr/Bis(ml) 3.33 1.00 10%SDS(ul) 2.50 0.75 10%AP(ul) 100 60 0.5M TEMED(ul) 5 5 混匀后小心地将分离胶注入准备好的玻璃凝胶模中（顶端剩余约 1.5-2cm 高度，以灌注浓缩胶） 。在顶端用移液器加入双蒸水，覆盖分离胶顶端，防止空 气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用室温静置半小时， 待凝胶与水界面出现后倒去 分离胶上层的水， 滤纸

29、吸干残留液体。 按上表配制浓缩胶， 注入分离胶上层空隙， 平玻璃盖板上缘，插入竖梳子，室温下放置半小时。 蛋白变性：根据蛋白定量结果将蛋白样品调至等体积（20ul）等浓度，充分 混合，加入上样缓冲液各 5ul。沸水中加热 10 分钟。 上样：将凝胶电泳板放在电泳架上夹紧（玻璃盖板相对内面放置） ，小心取出 竖梳子，将电泳液加入两块电泳板间并浸没浓缩胶面以上。将上样缓冲液用微量 14 上样器加于第一泳道及最后的一个泳道（有利于电泳时蛋白泳动均匀） 。将标准 蛋白分子加入第二泳道。在电泳槽内加入电泳液，其液面稍低于电泳架内的电泳 液面。 电泳：将电泳槽置于含冰块的盆中，接通电源，电压 80V，当样

30、本泳动至分离 胶时改为 120V 电压继续电泳， 当样本电泳至距凝胶底端约 1-2cm 处时断开电源。 电泳结束。 转膜：取 6 张滤纸及一张 PVDF 膜，剪成与电泳凝胶大小基本一致，其中三张 滤纸较凝胶的边长稍小 1-2mm。而 PVDF 膜较凝胶边长稍小 1mm。将滤纸及 PVDF 膜在转膜缓冲液中浸泡 3 分钟。将转膜缓冲液加入转膜电泳槽中，浸湿转膜缓冲 液的海绵平放在转膜塑料板上， 其上放 3 张浸湿的滤纸， 再将凝胶平放在滤纸上， 玻璃棒赶走凝胶下的气泡，加转膜缓冲液后将 PVDF 膜的左上角剪一小缺口（以 标记转膜后的正反面，贴在凝胶的为正面） ，赶走气泡，再将稍小的滤纸对齐平

31、铺在凝胶上， 其上铺浸湿转膜缓冲液的海绵后塑料夹板对夹固定。 置于转膜槽中， PVDF 膜侧接正极。 将转膜槽置于冰水盆中，接通电源，105mA 稳流转膜 6 小时。结束后断开电 源，取出 PVDF 膜，TBST 漂洗 3 次，每次 5 分钟。 封闭：将 PVDF 膜浸泡在封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST）中室温摇床震荡 1 小 时。然后 TBST 冲洗 3 次，每次 5 分钟。 COX-2 一抗孵育：根据兔抗人环氧化酶 2 蛋白印记多克隆抗体说明书按 1： 200 稀释，在培养皿中放一塑料膜，将稀释后的一抗约 2ml 滴加在塑料膜上，取 出 PVDF 膜，滤纸吸除大部分冲洗液，将 PVD

32、F 膜反贴（正面朝下接触一抗）在一 抗上， 如有气泡要将气泡赶出。在培养皿上加盖一个较大的培养皿以防止液体过 多蒸发。将培养皿放入 4冰箱过夜。 漂洗：取出于室温中 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 分钟。 COX-2二抗孵育：用反帖法孵育辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗， 1： 10000 稀释，室温轻摇 1 小时。 漂洗：TBST 漂洗 3 次，每次 10 分钟。 15 发光、显影、定影： 用保鲜膜贴于定影盒内的平板上，膜下可沾少许水以防止保鲜膜滑动。将 PVDF 膜去除多余 TBST 液后正面朝上贴于保鲜膜上。发光剂配制及发光、显影、 定影均在暗室内进行。暗室内将显影胶片剪成

33、PVDF 膜大小，发光剂按说明书配 制 1ml 于 EP 管中。将显影液、定影液分别倒在两个培养皿中。将发光剂滴加在 PVDF 膜上将另一页保鲜膜盖在 PVDF 膜上，待发光后将显影胶片贴在保鲜膜上， 盖上盒盖曝光（根据发光强度决定曝光时间，一般在 10 秒-1 分钟） 。取出胶片， 置于显影液及定影液中各 3 分钟，然后取出胶片在清水中漂洗 10 分钟，晾干。 PVDF 膜一抗、二抗去除：用一抗、二抗去除液漂洗 PVDF 膜两次，于摇 床上进行，各 5 分钟。 封闭：将 PVDF 膜浸泡在封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST）中室温摇床震荡 1 小 时。然后 TBST 冲洗 3 次，每次 5

34、 分钟。 -actin 一抗孵育：鼠抗人-actin 蛋白印记单克隆抗体孵育，反贴法于 4 冰箱中过夜。 漂洗：取出于室温中 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 分钟。 -actin 二抗孵育：用反帖法孵育辣根酶标记山羊抗鼠 IgG(H+L)二抗， 1： 10000 稀释，室温轻摇 1 小时。 漂洗：TBST 漂洗 3 次，每次 10 分钟。 发光、显影、定影：发光、显影、定影步骤同 2.15 步。 16 3 3、统计统计学学处理处理： 使用SPSS13.0统计学软件包进行统计学分析，数据以Xs表示,结果应用 2检 验及单因素方差分析, P0.05） ，如表 4 所示。 19 表 4 COX

35、-2 蛋白表达与鼻咽癌各临床病理学参数的关系(n) 项 目 n 阳性 阴性 阳性率（%） P 性别 男 25 20 5 80.00 女 8 7 1 87.50 0.544 年龄 50 16 12 4 75.00 50 17 15 2 88.24 0.298 病理 高、中分化 2 1 1 50.00 分级 低、未分化 31 26 5 83.87 0.335 淋巴结转移 无 13 8 5 61.54 有 20 19 1 95.00 0.025 T 分期 T1-T2 15 10 5 66.67 T3-T4 18 17 1 94.44 0。053 3.3 Western Blot 法检测结果： 用图像

36、分析软件 AlphaImager 2200 对图像条带进行灰度扫描， 结果用平均吸 光度（A）值表示（以 -actin 为内参照，平均A值=COX-2 的平均A值/-actin 的 平均A值） ，测定样本 COX-2 蛋白的相对表达量。 COX-2 蛋白在鼻咽癌组呈高水平表达，表达值达到 1.2580.034，高于鼻咽 炎组 0.4870.076，其表达差异有统计学意义（F=68.787,P=0.000） ，如图 7 所 示。 1 2 3 4 5 6 72kD COX-2 43kD -actin 图 7 Western Blot 法检测 COX-2 蛋白在鼻咽癌组织、鼻咽炎组织中的表达 1、3

37、、4、5、6 为鼻咽癌组织，2 为鼻咽部炎症组织 20 四、讨 论 4.1 关于鼻咽癌的相关基因 从癌基因到抑癌基因的研究， 人们已认识到细胞癌变及恶性肿瘤的发生发展 涉及到多因素、多步骤、多种基因突变(癌基因、抑癌基因及维持基因组稳定的 基因)的发展过程。鼻咽癌是一种由许多微效累加基因和众多环境因素共同作用 引起的疾病。 其发生发展过程具有明显的阶段性，从正常上皮-不典型增生-原位 癌-浸润癌-癌转移， 这为研究各阶段病变的分子生物学变化提供了很好的研究模 型。既往研究表明与鼻咽癌有关的癌基因有:LMPl 基因、c-myc 基因、bel-2 基 因、C-erbB-2 基因、ras 基因等，抑

38、癌基因有 p53、pl6、nm23 基因等。目前头颈 部肿瘤的研究主要集中在对原癌基因和抑癌基因的调节方面。 近年来研究表明真 核细胞翻译的调节在基因表达调控方面有非常重要的作用， 真核细胞翻译起始因 子环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)颇受关注。COX-2 被称为“快反应基 因” ，在正常的生理状态下几乎不表达或表达甚少，生长因子、细胞因子、炎性 介质， 促癌剂等多种因素可诱导 COX-2 的表达12。研究证实 COX-2 基因的扩增 及其蛋白的高度表达广泛出现在恶性肿瘤中13-14。COX-2 可通过促进细胞增殖、 抑制凋亡，促进肿瘤新生血管形成，促进肿瘤细胞浸润

39、，从而贯穿肿瘤发生发展 的整个过程15。但其在鼻咽癌组织中的表达及作用少有研究，而且所采用检测 方法主要为免疫组化方法，且结果亦不一。 4.2 COX-2 蛋白在鼻咽癌组织的表达意义 本研究采用免疫组织化学及蛋白印迹两种方法来检测 COX-2 蛋白在鼻咽癌 组织及鼻咽炎组织中的表达， 探讨其与鼻咽癌临床病理参数的关系及在鼻咽癌的 发展过程中的作用。本研究免疫组化结果显示，COX-2 蛋白在鼻咽癌组织中的阳 性表达率为 81.8%，与对照组鼻咽炎组织中的阳性表达率 25.0%的差异有统计学 意义（P=0.001） ，说明鼻咽癌在发生发展过程中表现出 COX-2 蛋白的上调表达。 本研究得出 CO

40、X-2 蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率与 CHAN17 报道的 83.0% 基本相当，高于周芳等18报道的 71.1 %，造成检测结果不一的原因可能与检测 试剂及鼻咽癌患者的病理特征不同有关。此外，蛋白印迹方法定量检测 COX-2 蛋白在鼻咽癌组织中的相对表达量为 1.2580.034，高于鼻咽炎组结果 0.487 21 0.076，差异亦有统计学意义（P=0.000） ，验证了免疫组织化学方法检测结果。 此结果表明 COX-2 在鼻咽上皮组织向鼻咽部癌变的过程中扮演了重要角色。 至于 对照组鼻咽炎组织中的 COX-2 蛋白 25.0%的阳性表达率，这在其它一些肿瘤的 研究中亦有同样的现象，如

41、乳腺组织、结肠组织、肺组织等，这可能是恶变的预 兆信号， 或具有潜在恶变的可能19,20。 值得对这些病例的跟踪随访等进一步研究。 通过探讨 COX-2 蛋白表达与鼻咽癌的病理参数关系可得出，COX-2 蛋白的 表达与淋巴结转移与否有关（P=0.025） ，而与性别、年龄、病理分级、T 分期无 显著相关（P0.05） ，表明 COX-2 蛋白的表达情况能反映鼻咽癌的侵袭、转移等 发展特征。 本研究结果未发现其表达情况与肿瘤分化明显相关，这可能是由于检 测样本数量不多及国内选择的病理组织绝大多数为非角化型有关。另外，西方人 种患鼻咽癌的几率比国内低的多，其病理类型主要为角化型，此类型研究结果表

42、明预后要差的多，复发的几率亦高的多21,22。因此，将此类对象一起纳入研究可 能有新的发现。 4.3 对本课题的进一步设想：COX-2 抑制剂与鼻咽癌 虽然 COX-2 蛋白在鼻咽癌的发生发展中起重要作用， 但是 COX-2 蛋白的高 表达与鼻咽癌的发生发展到底是伴随关系还是因果关系， 其抑制剂是否可用于治 疗鼻咽癌的化疗药物等问题尚需进一步研究与探讨。 Milas L等23发现使用选择性COX-2抑制剂可以阻止肿瘤的发生，减慢已发生 的肿瘤生长速度以及增强肿瘤对放、化疗的敏感性而减少对正常组织的副反应， 其机制一方面可能是对肿瘤细胞的直接作用，另一方面是对肿瘤血管的间接作 用。 Matthi

43、as C等24用30例咽部黏膜组织与塞来昔布及罗非昔布共孵一次至五次， 经双氧水处理后检测DNA碎片，结果发现经预孵养的样本其碎片显著减少，而且 随重复次数的增加碎片减少程度越明显，提示COX-2抑制剂除对机体免疫监视、 肿瘤血管形成及细胞增殖有影响外，它还有在一定氧化压力下表现出抗诱变效 应。另外，COX-2抑制剂提高肿瘤组织对放疗的敏感性可能是由于其能抑制因放 疗而损伤的肿瘤DNA重新修复， 这在Raju U等25的实验中得到了验证。 CHEN等26 用选择性COX-2抑制剂尼美舒利和塞来考昔作用于鼻咽癌细胞株， 可抑制肿瘤细 胞增殖及血管发生，其作用机制主要是使肿瘤细胞生长周期停滞以及诱

44、导凋亡， 另外，其可通过阻止DNA修复而增强放射治疗敏感性10。Lang等11研究亦表明 22 COX-2抑制剂可以解除或缓解因肿瘤细胞引起的免疫抑制从而增强机体的免疫 功能。由此可见，高选择性COX-2抑制剂可以阻止鼻咽癌肿瘤的发生、抑制肿瘤 细胞增殖及血管生成、抗基因突变及基因重新修复作用、增强机体的免疫力、增 强肿瘤细胞的放疗敏感性， 证明了COX-2抑制剂治疗鼻咽癌具有重大潜在价值这 一假设，同时也表明COX-2蛋白的高表达与鼻咽癌的发生发展更趋向于一种因果 关系。 COX-2抑制剂对鼻咽癌的作用机制尚不十分清楚，众多实验研究表明，抑制 剂竞争性与COX-2结合，抑制其作用于底物，从而

45、减少前列腺素的合成，进一步 抑制肿瘤细胞的分裂，促进细胞凋亡，抑制肿瘤的血管生成，减少自由基分子产 生，降低突变的可能性，增强机体的免疫力，从而达到防治肿瘤的目的。总之， 无论是独立应用还是作为放疗的辅助治疗或与其它抗癌药合用， COX-2抑制剂将 为鼻咽癌的预防和治疗提供新的靶点。 本研究结果显示，COX-2 蛋白在鼻咽癌组织较鼻咽炎组织中高表达，其在 鼻咽癌的发生、发展中起重要作用，可作为判断鼻咽癌的生物学行为、转移潜能 及预后的指标之一 ,也为临床鼻咽癌的治疗和预防提供新的靶点。但是，采用传 统的单纯放疗和 COX-2 抑制剂与放疗的联合治疗效果的差异是否有显著性、采 用检测 COX-2

46、 蛋白表达情况来预测患者鼻咽癌的生物学行为等尚需大量病例加 以证实，值得更深入地研究。 23 五、结 论 COX-2 蛋白在鼻咽癌组织中高度表达，与鼻咽癌的转移相关，有可能作为 判断鼻咽癌生物学行为、转移潜能的指标。 24 参 考 文 献 1Chang ET,Asami HO. The enigmatic epidemiology of nasopharyngeal carcinomaJ. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006;15(10):1765-1777. 2何丹，冯亮.COX-2与肿瘤关系的进展J. 实用临床医学，2008,9（1） ： 121-

47、125. 3Turini ME,DuBois RN.Cyclooxygenase-2: a therapeutic target J.Annu Rev Med.2002,53:35-57. 4Soo R,Putti T,Tao Q,et al.Overexpression of cyclooxygenase-2 in nasopharyngeal carcinoma and association with epidermal growth factor receptor expressionJ.Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2005,131(2):147-1

48、52. 5Harizi H,J uzan M,Pitard V,et al.Cyclooxygenase-2 issued prostaglandin enhances the production of endogenous IL-10,which downregulates dendritic cell functions J. Immunol, 2002, 168(5): 2255-2263. 6Lang S,Tiwari S,Andratschke M,et al.Immune restoration in head and neck cancer patients after in vivo COX-2 inhibitionJ.Cancer Immunol Immunother,2007， 56(10):1645-1652. 7Erovic BM,Pelzmann M,Turhani D,et al.Differential expression pattern of cyclooxygenase-1 and -2 in head and neck squamous c