PIG11诱导HepG2细胞凋亡及其机制的初步探讨.pdf

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1、 1 PIG11 诱导 HepG2 细胞凋亡及其机制的初步探讨 硕士研究生：王 燕 导 师：梁晓秋 教授 中 文 摘 要 目的：构建人 PIG11 的 miRNA 表达载体 pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR，建立低表 达 PIG11 基因的 HepG2 细胞株，联合采用本课题组前期已建立的 PIG11 蛋白稳定高表 达HepG2细胞株， 探讨PIG11蛋白表达对HepG2细胞凋亡的影响， 以及ROS和Survivin、 Caspase3、Caspase9 蛋白表达在凋亡过程中的作用。阐明 PIG11 诱导细胞凋亡的分子机 制。 方法：构建 4 个 miRNA 表达质粒，转化至感受态细菌

2、 DH5 挑取克隆测序。在脂 质体2000的协助下转染HepG2细胞， 经BSD筛选， 获得稳定PIG11蛋白低表达的HepG2 细胞。RT-PCR 和 Western Blot 分别从 mRNA 和蛋白质水平鉴定 4 组载体转染 HepG2 细胞后 PIG11 的表达情况，从中选取干扰效果最好的 1 组作为 PIG11 蛋白低表达的 HepG2 细胞模型。故后续实验分组为 HepG2 细胞、pLXSN-HepG2 细胞（空载体组细 胞） 、 pLXSN-PIG11-HepG2 细胞 （PIG11 高表达组细胞） 、 miR-PIG11-HepG2 细胞 （PIG11 低表达组细胞） 、miR

3、-NC-HepG2 细胞（干扰错义序列组细胞） 。利用 MTT 法和平皿克 隆形成实验检测细胞的生长情况；PI 染色流式细胞术检测其凋亡效应；DCFH-DA 荧 光探针标记细胞内 ROS，流式检测 ROS 水平的改变；Western Blot 测定 Survivin、 Caspase3、Caspase9 蛋白的表达情况。 结果：成功构建 4 组人 PIG11 的 miRNA 表达载体 pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR， 基因测序正确。转染后获得稳定细胞株，测定结果显示转染第 4 组干扰质粒的 HepG2 细胞 PIG11 mRNA 水平最低(p2.0） ，其中之一为 PIG11，这也表

4、明 PIG11 基因表达与肝细 胞癌凋亡密切相关9。最新实验证实 PIG11 可以在体外与双链 DNA 以序列非依赖性的 方式结合10。 综上所述，PIG11 作为一种新发现的基因，可能是人类肝细胞癌的抑癌基因，对肝 癌的诊断与治疗有一定作用。我们推测 PIG11 具有较强抑制肝癌细胞生长的作用，是 通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现，但 PIG11 蛋白在凋亡通路中的具体作用机制还不清楚。 Polyak 等1曾进行了进一步的研究：PIGs 诱导发生在 Ad-p53 感染细胞的 6h 左右， ROS 水平的变化可在 18h 后观察到，21h 后谷胱甘肽的浓度下降 48 12%，即引起胞内 的氧化应激。

5、而线粒体脂质的降解发生在可测量 ROS 上升开始后 3-6h，同时伴随着凋 亡形态学和生化特征的发生。该时间过程暗示一个级链反应：p53 转录诱导的氧化还原 控制基因（PIGs） ，导致 ROS 产生线粒体破坏凋亡。 因此 PIG11 蛋白在细胞内的作用可能与胞内的氧化还原状态有关，研究胞内 ROS 变化及 ROS 的产生来源，细胞内的氧化还原状态与高表达 PIG11 蛋白的细胞凋亡效应 之间的关系，以及 ROS 变化和线粒体介导凋亡通路在其过程中的作用，对阐明 PIG11 蛋白的相关分子机制有重要意义。 本课题组前期已经证实 PIG11 蛋白稳定高表达可诱导细胞凋亡，且 PIG11 蛋白稳

6、定高表达引起 HepG2 细胞内活性氧变化和 m 下降。本实验采用 miRNA 的基因沉默 技术建立 PIG11 蛋白稳定低表达 HepG2 细胞株并利用已建立的 PIG11 蛋白稳定高表达 HepG2 细胞株，进一步探讨 PIG11 蛋白表达对 HepG2 细胞凋亡的影响，以及 ROS 和 线粒体在凋亡过程中的作用，阐明 PIG11 诱导细胞凋亡的分子机制。 7 实 验 材 料 1.1 菌株与质粒 E.coli DH5 由本所保存，载体 pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR 购自 Invitrogen 公司。 1.2 细胞 HepG2 细胞由中南大学细胞中心引进。 1.3 主要试剂 1、

7、Lipofectamine2000：Invitrogen 公司；BSD：sigma 公司；G418：Amresco 公司 spectinomycin：sigma 公司； 2、DMEM-high、RPMI-1640 培养基：GIBCO 公司； 3、胰蛋白酶：Amresco 公司； 4、小牛血清：杭州四季青公司； 5、PCR 试剂盒：Promega 公司； 6、DEPC：Amresco 公司； 7、Trizol：BBI 公司； 8、MTT：sigma 公司； 9、PIG11 蛋白抗体由中国科学院生物物理研究所曹恩华研究员惠赠； 10、抗 -actin 抗体、Caspase 3 抗体、Survivi

8、n 抗体、抗兔、抗鼠二抗：Santa Cruz 公司；Caspase 9 抗体：ABZOOM 公司； 11、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5X） ：碧云天公司； 12.、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒：碧云天公司； 13、DNA marker：东盛生物； 14、BCA 蛋白定量试剂盒：Pierce 公司； 15、质粒小量提取试剂盒（Endo-free plasmid Mini Kit ） ：Omega 公司； 16、活性氧检测试剂盒：碧云天公司； 17、逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)：MBI 公司； 18、载体构建试剂盒

9、 BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP ：Invitrogen 公司； 19、其他试剂均为国产或进口分析纯。 8 1.4 引物：由 Invitrogen 公司合成。 PIG11 特异引物：根据已有质粒 pcDNA3.1/NT-GFP-PIG11 设计，片段长 400bp， 并由 Primer Premier5.0 软件辅助分析。 上游引物 P1： 5-GCGAATTCCAACACCGATGCACACA-3 含有 EcoR I 酶切位点 下游引物 P2： 5-CGCGGATCCTAGGCAGCTCTTTAGG-3 含有

10、 BamH I 酶切位点 内参 -actin 引物：由 Primer Premier5.0 软件设计，片段长 282 bp。 上游引物 P3：5- AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT -3 下游引物 P4：5- GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT -3 1.5 仪器设备 1、二氧化碳细胞培养箱：美国 SHEL-LAB 公司； 2、医用净化工作台：苏州净化设备公司，型号 YJ-875； 3、酶联免疫检测仪：第四军医大学，国营华东电子管厂联合研制，型号 DG3022； 4、倒置显微镜：日本 OLYMPUS 公司； 5、光学显微镜：日本 OLYMPUS 公司； 6

11、、流式细胞仪：美国 Bechman Coulter 公司生产的 Epics Altra 型，随机分析软件为 MultiCycle； 7、薄层色普扫描仪：日本公司，CS-930 型； 8、垂直电泳仪、电泳槽及转膜系统：美国 BIO-RAD 公司； 9、DDY-5 型稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂； 10、高速离心机：德国 Eppendorf 公司，5804 及 5804R 型； 11、电子分析天平：美国 Sartorius 公司； 12、微量移液器（10L、20L、100L、1000L） ：德国 Eppendorf 公司； 13、凝胶成像分析系统：美国 UVP 公司，GOS7500 型； 14、

12、低温离心机：Sigma 公司； 15、低温高速离心机：德国 Eppendorf 公司； 16、-80低温冰箱：SANYO 公司； 17、PH 计：Sartorius 公司，PP-15E 型； 18、SIM-F123 制冰机：日本 SANYO 公司； 19、Heto-Holten 冷水循环仪：丹麦 Heto-Holten 公司。 9 技 术 路 线 1 miRNA干扰载体的构建 2 转染HepG2细胞，挑选及鉴定阳性克隆 3 PIG11蛋白表达对HepG2细胞的影响 重组质粒 pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA-PIG11 干扰错义序列质粒 pcDNATM6.2-GW/EmGFP

13、 miRNA-NC 脂质体转染法分别转染 HepG2， 杀稻瘟菌素（BSD）筛选 分别挑取阳性克隆 RT-PCR 、Western Blot 鉴定 pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA-PIG11-HepG2 细胞 （以下简称 miR-PIG11-HepG2） pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA-NC-HepG2 细胞 （以下简称 miR-NC-HepG2） HepG2 pLXSN-HepG2 pLXSN-PIG11-HepG2 miR-PIG11-HepG2 miR-NC-HepG2 细胞生长情况 凋亡效应 ROS 水平 蛋白表达情况 MTT 法 PI 染色染流

14、式细胞术 流式细胞仪 Western Blot 平皿克隆形成实验 根据ID 9537基因序列设计并合成干扰错义序列及4对miRNA oligo序列 利用载体构建试剂盒进行重组克隆，构建表达质粒 质粒转化至感受态细菌 DH5 扩增 提取各组质粒 10 实 验 方 法 1 重组载体 pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA-PIG11 的构建及鉴定 1. 1 根据 ID 9537 基因序列设计并合成干扰错义序列及 4 对 miRNA oligo 序列(表 1) 表 1 干扰错义序列及 4 对 miRNA oligo 序列 干 扰 错 义序列 tgctgAAATGTACTGCGCGTGGA

15、GACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTC CACGCAGTACATTT SR111- 1-F TGCTGAGAAGAGCACAGCAGAGACGAGTTTTGGCCACTGACTGACTC GTCTCTTGTGCTCTTCT SR111- 1-R CCTGAGAAGAGCACAAGAGACGAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTCGTC TCTGCTGTGCTCTTCTC SR111- 2-F TGCTGAAGGCAAGCGCCATGATGGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGC CATCAGCGCTTGCCTT SR111- 2-R CCTGAAGGCAAGCGC

16、TGATGGCAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTGCCA TCATGGCGCTTGCCTTC SR111- 3-F TGCTGTAGAGAGCGTTCCACATGATCGTTTTGGCCACTGACTGACGATC ATGTAACGCTCTCTA SR111- 3-R CCTGTAGAGAGCGTTACATGATCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGATCAT GTGGAACGCTCTCTAC SR111- 4-F TGCTGACATGAGGCCCGTCTCAGCTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAG CTGAGGGGCCTCATGT SR111- 4-R CCTGACA

17、TGAGGCCCCTCAGCTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGCTG AGACGGGCCTCATGTC 1.2 退火、连接及转化 （1）oligo 退火 将合成好的 oligo 用 ddH2O 溶解成 100M，互补单链各取 5l 两两混合，按表 2 给出体系进行退火。然后将 4 份 oligo 混合物在 95加热 5 分钟，然后放置室温自然 冷却 20 分钟，形成双链 oligo。 表 2 miRNA oligo 退火体系 试剂 剂量 100M top strand oligo 5l 100M bottom strand oligo 5l 10 oligo annealing

18、buffer 2l ddH2O 8l Total volume 20l （2）连接 将退火的双链 oligo 继续稀释成 10nM 浓度， 按表3 给出体系在室温连接 30分钟。 11 表 3 酶连接体系 试剂 剂量 5 ligation buffer 4l pcDNA6.2-GW/EmGFP 2l ds oligo(10nM) 4l T4 DNA ligase（1U/l） 1l ddH2O 9l Total volume 20l （3）转化 取新鲜或冻存感受态 200l，加 5l 连接产物，混匀，置冰上 30min，42热休克 90s，立即置冰上 2min，加无抗生素的 LB 培养基 800

19、l，37缓慢摇振 45min（4050 rpm）。取 200l 转化菌涂于含壮观霉素的 LB 琼脂板上，37培养过夜。同时作一阴 性对照板，涂感受态细菌，以了解感受态细菌有无抗性。 1.3 测序鉴定 每个转化平板分别挑取 3 个克隆进行测序， 以验证重组克隆中插入片段序列是否与 设计的 oligo 序列一致。 2 抽提各组质粒 从冷冻保存的 E.coli DH5（包含 pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA-PIG11 质粒） 菌种挑取一环，接种于含 50g/ml 壮观霉素的 LB 固体培养板上，37培养过夜，从平 板中选取一个菌落，转种于 LB 液体培养基中，37摇振培养过夜。按

20、 omega 质粒小量 抽提试剂盒说明书方法抽提质粒。步骤： （1）将带有目的质粒的 E.coli 接种于裝有 5ml LB/氨苄青霉素的 10-20ml 的培养管， 37搖床培养 1216 h， 以扩增质粒。（2） 取 1.55.0 ml 的菌液，于室温下 10000 rpm 离心 1min 以沉淀菌种。（3）倒出或吸出培养基，弃 去。往沉淀中加入 250l Solution/RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。 （4）往重悬混和液中加入 250l Solution ，轻轻颠倒混匀 7-10 次。如有必要，可把 裂解液置于室温静置 2min， 避免剧烈混和裂解液， 否则会使染色

21、体 DNA 断裂而使得到 的质粒纯度降低。 裂解反应不要超过 5min。 （5） 往上述混和液中加入 125l 冰浴 Buffer N3， 并温和地上下颠倒离心管数次混匀， 直至形成白色絮状沉淀。 （6） 室温下， 12000 rpm 离心 10min。（7）小心将上清倒入干净的 1.5ml 离心管中，加入 0.1 倍体积的 ETR 溶液（蓝色）至上清液中，颠倒试管 7-10 次，然后于冰浴中静置 10min。注意：在加 入 ETR 溶液后，裂解液可能出现浑浊，但冰浴后将逐渐转为澄清。（8）将上述裂解液 于42下静置5min。 裂解液又将再次出现浑浊。 此时， 立即于25 12000rpm离心

22、3min， 12 ETR 溶液将在试管底部形成蓝色分层。（9）将上清液移至另一新的 1.5 ml 离心管中， 加入 1/2 倍体积室温的无水乙醇，轻轻颠倒试管 6-7 次，室温放置 1-2 min。（10）取 一干净的 HiBind Mini Columns(I)裝在一个 2ml 收集试管上(已备)。小心吸出上清，取 700l 样品溶液将其转至于柱子內，于室温下 10000 rpm 离心 1min，使裂解液完全流过 柱子。 3 细胞培养 HepG2 细胞培养于含 10%小牛血清的 RPMI 1640 完全培养基中，均置于 37、 5%CO2、湿度 95%的培养箱内。培养细胞呈单层生长，融合贴壁

23、达 90%时传代。传代 时常规吸去培养液，用 0.25%胰蛋白酶消化，在显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间 隙增大后，立即倾去胰酶，加适量含血清培养液吹打成单细胞悬液，常规传代。 4 细胞转染 4.1 BSD 筛选浓度的确定 以 4 104细胞孔接种 HepG2 细胞入 24 孔培养板，第二天（细胞至 70-80%融合） 在各孔中依次加入 0.5g/mL、1g/mL、2g/mL、3g/mL、4g/mL、5g/mL、6g/mL、 7g/mL、8g/mL 浓度的 BSD，一式两孔。正常培养条件培养，每 2-3 天换液一次，维 持 BSD 浓度不变，连续培养九天。选取的 BSD 浓度为该培养条件下细

24、胞在第九天时全 部死亡的最低浓度，本实验中 4g/mL BSD 浓度较为理想。 4.2 脂质体转染 HepG2 细胞 按照 Lipofectamine2000 说明书进行细胞转染。 （1）胰酶消化并计数 HepG2 细胞， 1 105细胞/mL，接种 500L 到 24 孔板，常规条件下培养 24h，细胞融合至 60-70 水平即可开始转染实验。（2） 稀释0.8g质粒DNA于无血清的优化培基中， 总体积50L， 轻轻混匀， 得到 A 液。（3） 取 2L 脂质体 2000 稀释于无血清优化培基中， 总体积 50L， 轻轻混匀，室温下孵育 5min 得到 B 液。 （4） 将 A 与 B 液轻

25、轻混匀，室温孵育 20min。 （5） 将 100L 上述混合液混匀，加入 24 孔板，然后加入 400L 优化培基。 （6） 细胞 置于 37，5CO2 培养箱内，孵育 4-6h，换成 10小牛的 1640 培养基。 （7） 24h 后， 细胞以 110 的比例传代，注意吹匀，每孔 500L。24h 后，换成 2g BSD+500L 培 基/孔，筛选阳性克隆，3 天换一次筛选培基。待大部分细胞死亡后将 BSD 浓度减半， 持续培养 2W，可见阳性细胞克隆。 （8） 将混合细胞克隆消化计数，调整细胞浓度至 10 个细胞/mL，接种于 96 孔板，100L/孔，接种 24h 待细胞贴壁后，在倒置

26、显微镜下 13 观察，并标记单个细胞的培养孔，剩余细胞冻存。 （9） 扩增细胞，并在细胞增殖铺满 培养孔后，依次转入 24 孔、6 孔板，25mL 培养瓶，冻存细胞，并对细胞进行鉴定。 5 RT-PCR 鉴定各组转染后细胞 PIG11 mRNA 表达情况 5.1 材料准备 所有 EP 管、Tip 头均用 0.1%DEPC 水浸泡过夜后高压蒸汽灭菌 20min，65烤干。 5.2 细胞总 RNA 的提取 收集细胞 23 106， 用 PBS 洗 2 次， 尽量倒去残留的 PBS； 每瓶细胞加入 Trizol 1ml， 室温裂解 5min。加氯仿 200l，振荡 15sec，置室温 2min。12

27、000rpm，4离心 10min， 仔细吸取上层水相，移至另一 Ep 管。加入等量异丙醇，充分混匀，室温静置 15min， 12000rpm，4离心 15min，弃上层水相。加冰冷 75%乙醇 1ml，充分洗涤沉淀，小于 7500 rpm 4离心 5min，弃上清，室温干燥 510 min。加入 20l 无酶水溶解 RNA，取 5l 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的质量。 5.3 cDNA 第一链合成 细胞总 RNA 5l Oligo(dT)18 primer 1l DEPC 水 6l 65孵育 5min。 置于冰上，短暂离心 5 分钟。 按顺序加入下列试剂至装有上述 RNA 模板的 E

28、P 管中： 5 RT Buffer 2l dNTP Mixture 2l RNase Inhibitor 1l M-MuLV 逆转录酶 1l 总体积 20l 轻轻混匀并离心， 45保温 1h，cDNA 链合成后置于 70保温 15min，灭活反转 录酶，终止反应。产物-20保存。 5.4 PCR 反应 扩增体系如下： cDNA 模板 2l GoTap Green Master Mix 12.5l 14 上游引物（P1/P3） 1l 下游引物（P2/P4） 1l 无酶水 8.5l 总体积 25l 反应条件： 94， 预变性 5min 后； 进行 30 个循环： 94变性 1min， 52 （PI

29、G11） 、 55（-actin）退火 1min，72延伸 1min，循环 30 次，最后 72延伸 5min，反应产 物保存于-20。取 5l 反应产物，1%琼脂糖电泳分析。采用图像分析软件获取各扩增 条带的灰度值比值， 即 PIG11 mRNA 表达的相对强度=PIG11 条带灰度值/-actin 条带灰 度值，统计数据供分析。 6 Western Blot 鉴定各组转染后细胞 PIG11 蛋白表达情况 6.1 细胞蛋白样品的制备 收集细胞 25 106，用冰预冷的 PBS 洗两次，尽量吸净残留的 PBS。加适量悬浮裂 解液到细胞中， 将细胞刮下置于 EP 管中， 放置冰上 30 分钟。

30、4离心 12000rpm 10min， 收集上清，即为细胞总蛋白。用 BCA 法进行蛋白定量。-80保存。 6.2 Western Blot 调节每份样品浓度，以每孔 20l 的蛋白量体积上样，样品加入 1/5 体积的 5 SDS 上样缓冲液，100煮沸 5min，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。积层胶与分离胶的浓度分别 为 5%和 15%。应用不连续缓冲系统进行垂直电泳（积层胶 28mA、25-30min，分离胶 105V、90min） ，待溴酚兰指示剂达分离胶下部，断开电源。取下凝胶，用转移缓冲液 浸泡数分钟，用蛋白湿转移装置将蛋白转移到 PVDF 膜上（转膜条件 80mA、135min

31、， 适用于小分子量蛋白） 。用含 5%脱脂奶粉的 TBST 液封闭 2 小时，加入适当浓度 I 抗 （PIG11,1:300） ，4孵育过夜，然后用 TBST 漂洗膜 3 次，每次 5min。加入 II 抗(浓度 1:5000)37孵育 1 小时，TBST 洗 3 次，每次 5min。后在显色液中避光显色，出现条 带后立即在定影液中定影以中断显色反应。薄层扫描仪（日本产，型号 CS-930）扫描， Alphazmager2200 软件测定印迹区带的光密度值。以 -actin 为内参照，统计数据以供分 析，数据以x s 表示。从中选取干扰效果最好的一组进行后续实验。 7 细胞生长情况的检测 7.

32、1 MTT 法检测细胞的生长速率 将 HepG2 、 pLXSN-HepG2 、 pLXSN-PIG11-HepG2 、 miR-PIG11-HepG2 及 15 miR-NC-HepG2 各组细胞用 0.25%胰酶消化，细胞计数后制成 2104 细胞悬液，每孔 200 l，接种于 96 孔培养板。细胞接种后 24h，每孔加 MTT 溶液 20 l( 5 mg/ml，用 pH7.4 的 PBS 配制)。 继续孵育 4h， 终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液， 每孔加 100l 二甲基亚砜，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。选择 570 nm 波长，空白对照调零，在 酶标仪上测定各孔吸光度（

33、A） 值，记录结果，连续测定 4 d，最终以时间为横坐标、 A 值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 7.2 平皿克隆形成实验 取对数生长期的以上各组细胞以每孔约 300 个接种于 24 孔板中，以 RPMI 1640 培 养液培养 10 d， 弃去培养液， 用 0. 01 mol/ L PBS (pH 7. 4) 浸洗两次， 甲醇固定 15 min， 弃去固定液，加适量姬姆萨染色 1030 min，然后洗去染液，空气干燥。计算每孔的 克隆数。50 个细胞以上的细胞集落算一个克隆，并计算克隆形成率。 8 凋亡效应的检测 收 集 HepG2 、 pLXSN-HepG2 、 pLXSN-PIG11-Hep

34、G2 、 miR-PIG11-HepG2 及 miR-NC-HepG2各组细胞1106-2107，用冰预冷的PBS洗涤细胞2次。1000rpm 5min， 离心去上清。用冰预冷的PBS液重悬细胞，1000rpm 5min离心，去上清。加入70%乙醇 1mL， 4固定过夜， 冰盒送检。 检测前， 冷PBS洗2次， 15L RNaseA （10g/L） 作用3-5min， 再加入400L碘化丙锭 （PI,50mg/L） ， 4避光作用30min， 300目尼龙网滤过， 上机检测。 计数10000个细胞，进行DNA含量分析，所有数据通过仪器软件被收集、储存和分析。 9 ROS 水平测定 应用活性氧检

35、测试剂盒进行分析，荧光探针 DCFH-DA 进行标记。DCFH-DA 本身 没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内或线粒体内后，能被细胞内或线粒体内的 酯酶水解成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜或线粒体膜，而使探针很容易被装载到 细胞或线粒体内。细胞或线粒体内的活性氧可以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF。通过检测 DCF 的荧光就能知道细胞或线粒体内活性氧的水平。本实验用流式细 胞仪测定反应体系中 DCF 的荧光量。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是含活性巯基化合物， 活性氧清除剂11,12。 步骤如下： 收集 HepG2、 pLXSN-HepG2、 pLXSN-PIG11-H

36、epG2、 miR-PIG11-HepG2 及 miR-NC-HepG2 各组细胞 1106-2107。DCFH-DA 探针按 1：1000 用无血清培养 液稀释，使终浓度为 10mol/L，分装在 1.5mL 的 EP 管中。细胞收集后，预冷 PBS 洗 16 涤细胞 2 次，1000rpm，5min，离心去上清，将细胞悬浮于稀释好的 DCFH-DA 溶液中， 37细胞培养箱内孵育 20min。 每隔 3-5min 颠倒一下， 之后用无血清培养液洗涤细胞 3 次，上机检测，激发波长 488nm，发射波长 525nm。所有数据通过仪器软件被收集、 储存和分析。 10 蛋白表达情况的检测 提 取

37、 HepG2 、 pLXSN-HepG2 、 pLXSN-PIG11-HepG2 、 miR-PIG11-HepG2 及 miR-NC-HepG2各组细胞蛋白，Western Blot检测Survivin(1:800)、Caspase3(1:800)、 Caspase9(1:500)蛋白表达情况，方法同6。 11 统计学处理 采用 Spss13.0 统计分析软件包， 进行 one-way ANOVA 检验及两个独立样本的 T-test 分析，数据以x s 表示，确定 p0.05 有统计学意义。 17 实 验 结 果 1 重组质粒载体 pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA-PIG1

38、1 的构建及鉴定 成功构建载体，插入位点正确（图 1） ，测序结果见插入片段方向正确，有一完整 的读码框，含起始密码子和终止密码子（图 2） 。 图 1 载体 pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR 图谱 1 18 图 2 各组干扰质粒平板克隆测序图谱 1：干扰组 1； 2：干扰组 2； 3：干扰组 3； 4：干扰组 4。 2 PIG11 基因稳定低表达 HepG2 细胞株的鉴定 2.1 各干扰组细胞阳性克隆 2 4 3 19 分别将干扰错义序列质粒及 4 组重组质粒 pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA-PIG11 同时转染 HepG2 细胞，经 BSD 筛选得到阳性细胞克隆

39、（图 3） 。 图3 转染miR-PIG11质粒的各组HepG2细胞BSD筛选后的阳性克隆（ 400） 1：干扰组1；2：干扰组2；3：干扰组3；4：干扰组4；5：miR-NC-HepG2（干扰错义序列组） 。 2.2 RT-PCR 鉴定干扰效果 提取各组细胞总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳显示28S RNA和18S RNA条带清晰， 且28S亮度是18S的2倍以上，小片段5S RNA带清晰可见（图4） ，验证了总RNA的完整 性。对各组细胞进行mRNA水平的检测，以-actin (282bp)做为内参照，结果显示转染 的各组HepG2细胞PIG11 mRNA均有下调，以干扰组4最明显（p0.

40、01） （图5） 。计算各 组干扰载体的干扰率，与RT-PCR结果一致，其中干扰组4的干扰率最高，达到71.5%。 （表4） 图4 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性 1：干扰组 1；2：干扰组 2；3：干扰组 3；4：干扰组 4；5：miR-NC-HepG2。 1 2 3 4 5 28S 18S 1 2 3 4 5 5S 20 A B 图 5 RTPCR 检测各组细胞 PIG11 mRNA 的表达 A: 各组 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳结果 B: PIG11 的 RT-PCR 直方统计图 1、 8： DNA Marker； 2： 干扰组 1； 3： 干扰组 2； 4： 干扰组 3； 5：

41、干扰组 4； 6： miR-NC-HepG2； 7： control （HepG2 细胞） 。 干扰 3、 4 组的 mRNA 水平均降低， 以干扰组 4 最低， * p0.01 vs control， # p0.01 vs 干扰组 3。 表4 RT-PCR结果的半定量灰度分析 group PIG11 -actin PIG11/-actin Sample/ PIG11 Ratio of inhibition(%) 干扰组1 8.6 9.5 0.90526 0.925 7.5 干扰组2 7.4 7.9 0.93671 0.957 4.3 干扰组3 5.9 7.7 0.76623 0.783 21

42、.7 干扰组4 3.6 12.9 0.27907 0.285 71.5 miR-NC-HepG2 9.5 9.9 0.95959 0.98 2 control 9.4 9.6 0.97917 1 0 2.3 Western Blot 鉴定干扰效果 结果显示： 干扰组4的PIG11蛋白表达量最低 （p0.01） ， 与RT-PCR结果基本一致 （图 6） 。故后续实验选取干扰组4细胞为PIG11低表达的HepG2细胞模型，以下称为 miR-PIG11-HepG2细胞。 pig11(400bp) -actin(282bp) 300bp 500bp 1 2 3 4 5 6 7 8 A B 21 图6

43、 Western Blot检测各组细胞PIG11蛋白表达 A: 各细胞组 PIG11 蛋白的 Western Blot 分析 B: PIG11 的 Western Blot 直方统计图 1：干扰组 1；2：干扰组 2； 3：干扰组 3； 4：干扰组 4； 5：miR-NC-HepG2； 6：control。干 扰组 3、4 的 PIG11 蛋白水平均降低，以干扰组 4 最低，*p0.01 vs control，# p0.01 vs 干扰组 3。 3 PIG11 基因表达对 HepG2 细胞生长的影响 3.1 MTT 法检测细胞生长速率 结果显示 pLXSN-PIG11-HepG2 细胞生长明显

44、受抑制 （p0.01） , miR-PIG11-HepG2 细胞生长明显加快（p0.01）(表 5，图 7)。 表 5 各组细胞 MTT 实验结果 group MTT（OD 值） （） 24h 48h 72h 96h control 0. 890.12 0.940.01 0.960.01 1.30.04 pLXSN 0.880.19 0.920.02 0.950.02 1.050.05 pLXSN-PIG11 0.700.01* 0.640.01* 0.680.02* 0.670.08* miR-PIG11 1.050.04* 1.190.05* 1.320.03* 1.360.01* miR

45、-NC 0.870.01 0.930.12 0.950.01 0.980.02 附注：* p0.01 PIG11 1 2 3 4 5 6 -actin A B 22 图7 MTT法绘制的各组细胞生长曲线（*p0.01） 3.2 平皿克隆形成实验检测各组细胞克隆形成率 实验结果显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞生长明显减慢 （p0.01） ， miR-PIG11-HepG2 细胞生长明显加快（p0.01） ，结果与MTT结果一致（图8）。 1 2 3 4 5 A * * * * * * * * 23 4 PIG11 基因表达对 HepG2 细胞凋亡的影响 PI 染色流式细胞术检测结果显示

46、：HepG2 细胞、pLXSN-HepG2 细胞、 pLXSN-PIG11-HepG2 细胞、miR-PIG11-HepG2 细胞、miR-NC-HepG2 细胞的凋亡率分 别为 5.72%0.81、5.34%0.60、34.83%2.29、1.34%0.71、5.10%0.40。 pLXSN-PIG11-HepG2 细胞凋亡率显著高于其余各组（p0.01） ，miR-PIG11-HepG2 细胞 显著低于其余各组（p0.01） （图 9） 。 图8 平皿克隆形成实验结果 A：各组细胞平皿克隆的肉眼 观 B： 各组细胞平皿克隆 的镜下观（ 100） C：各组 细胞克隆形成率直方统计图 （实验重

47、复三次） ， * p0.01 vs control 。 1 ： control ； 2： pLXSN-HepG2； 3 ： pLXSN-PIG11-HepG2 ； 4：miR-PIG11-HepG2； 5： miR-NC-HepG2。 C B 1 2 3 4 5 24 图 9 流式细胞仪检测细胞凋亡率 A：各组细胞的凋亡率 B：各组细胞凋亡率直方统计图（实验重复三次） ，*p0.01 vs control。 1： control； 2： pLXSN-HepG2； 3： pLXSN-PIG11-HepG2； 4： miR-PIG11-HepG2； 5： miR-NC-HepG2。 5 PIG11

48、 基因表达诱导 HepG2 细胞凋亡中 ROS 水平的作用 用流式细胞仪测定反应体系中 DCF 的荧光量， 结果显示： HepG2、 pLXSN-HepG2、 pLXSN-PIG11-HepG2、miR-PIG11-HepG2、miR-NC-HepG2 各组细胞内的平均荧光强 度分别为 5.52 0.97、4.92 0.71、15.71 0.82、2.39 0.22、5.12 0.15。与 HepG2 细胞比 较，pLXSN-PIG11-HepG2 细胞平均荧光强度明显增高（p0.05） ，miR-PIG11-HepG2 细胞平均荧光强度降低（p0.05） ，说明 PIG11 高表达可诱导胞内 ROS 水平的升高，而 低表达可抑制胞内 ROS 水平的升高。使用 ROS 清除剂 NAC 后，各组细胞内的 ROS 水平降低， 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率结果显示 pLXSN-PIG11-HepG2 细胞凋亡率 为 16