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1、江苏大学硕士学位论文 摘要 我国染料行业与纺织印染业发达，其产生的废水中含有大量染料，对环境的污染极为严 重。其中8 0 以上的染料为偶氮染料、蒽醌染料以及三苯甲烷染料等“三大家族染料。这 些染料大多为多聚芳香环复杂有机化合物，为有毒难降解有机物。其化学稳定性强，具有致 癌、致畸、致突变的“三致”作用。由于传统物理化学方法具有成本高，生态友好型不够等 缺点，开展环境微生物降解和吸附染料的研究成为环境保护领域的热点。本文详细地研究了 & o n e i d e n s i sM R 1 菌株降解磺化高分子量三苯甲烷染料苯胺蓝的性质，并对其降解机制进行 了深入的研究，另外在前二者研究基础上还进行了
2、该菌与纳米材料联合降解苯胺蓝的应用研 究。论文的主要研究结果如下： ( 1 ) So n e i d e n s i sM R 1 菌株对苯胺蓝的脱色脱毒降解行为研究。本文研究了不同染料 浓度、温度、p H 、电子供体、盐浓度等因素对苯胺蓝脱色的影响。结果显示So n e i d e n s i sM R 1 对苯胺蓝具有较高的脱色能力，即使初始浓度为1 0 0 0m g L ，经过& o n e i d e n s i sM R 1 处理 9 6h 后，脱色率仍能达到约8 0 。在p H 为7 0 、温度为3 0 。C 时，& o n e i d e n s i sM R 1 的脱色 速率最
3、高。另外，乳酸和甲酸更加适合作为降解苯胺蓝时& o n e i d e n s i sM R 1 的电子受体。 & o n e i d e n s i sM R 1 对高盐度的耐受性极强，在氯化钠浓度为6 0g L 时，& o n e i d e n s i sM R 1 对5 0m g L 苯胺蓝仍具有一定脱色能力。脱色产物化学分析结果与吸附试验结果表明，& o n e i d e n s i sM R 1 对于苯胺蓝的脱色为降解行为。此外，本文对苯胺蓝与其降解产物的植物毒 性和细胞遗传毒性进行了评估，实验结果表明，& o n e i d e n s i sM R 1 对苯胺蓝的脱色降解也为
4、 脱毒行为。 ( 2 ) o n e i d e n s i sM R 1 对苯胺蓝的脱色降解机制研究。在厌氧还原苯胺蓝时，& o n e i d e n s i sM R 1 细胞内电子通过一条非常规的M t r 路径进行传递。即虽然M t r 电子传递途径 中M t r A 、M t r B 、或M t r C O m c A 的突变体对苯胺蓝的脱色率显著低于野生型对苯胺蓝的脱 色率，但是M t r 电子传递路径中最关键的电子载体C y m A 的缺失却不影响苯胺蓝的脱色率。 & o n e i d e n s i sM R 1 在无外源电子受体参与的情况下，对苯胺蓝4 8h 的降解率能够
5、达到9 2 ； 然而在分别加入D M S O 、硝酸盐、水合氧化铁或者T M A O 后，苯胺蓝降解率受到不同程度 的抑制。另外，通过添加电子介质核黄素，能够显著增加苯胺蓝的脱色速率。结合G s p DI I 型分泌系统干扰突变体的结果，表明o n e i d e n s i sM R 1 对苯胺蓝的脱色降解是一个膜电子 传递引起的胞外还原过程。 ( 3 ) 纳米氧化钛与& o n e i d e n s i sM R 1 联合降解苯胺蓝的探索研究。厌氧情况下，纳米 产电细菌S h e w a n e l l ao n e i d e n s i sM R 1 对磺化三苯甲烷染料苯胺蓝的脱色降
6、解及其机制研究 氧化钛在光照下能够降解苯胺蓝，其降解率达到6 5 ；同时加入纳米氧化钛和& o n e i d e n s i s M R 1 后，3 6h 降解率比单独& o n e i d e n s i sM R 1 降解苯胺蓝的效率提高1 3 。 ( 4 ) 纳米材料促进接合转移效率的So n e i d e n s i sM R 1 转化方法探索。纳米氧化钛能够 促进外源基因的接合转移效率，能提高1 0 倍以上。实际应用中，应当选用终浓度为O 5m M 、 平均粒径为2 5h i l l 的纳米氧化钛。 本文用产电细菌对磺化高分子量三苯甲烷染料进行了脱色研究，提出了S h e w a
7、 n e l l a 降解 三苯甲烷染料的降解机制，为该菌属对三苯甲烷染料的降解研究进行了深入的补充。另外， 对纳米材料在微生物染料降解的研究与应用提供了理论与现实基础。 关键词：厌氧脱色，降解机制，苯胺蓝，S h e w a n e l l ao n e i d e n s i sM R 1 ，纳米氧化钛 l I 江苏大学硕士学位论文 A b s t r a c t D y ea n dt e x t i l ei n d u s t r i e sa r ed e v e l o p i n gq u i c k l yi nC h i n a , 丘o mw h i c ht h es
8、e w a g ec o n t a i n s l a r g ea m o u n t so fd y e s ，a n dr e s u l t si nc u r i o u se n v i r o n m e n tp o l l u t i o n M o s to ft h e s ed y e sa r e a r o m a t i cc o m p l e xo r g a n i cc o m p o u n d s ，w h i c ha r et o x i c a la n dd i f f i c u l tf o rd e g r a d a t i o na
9、 sw e l l T h e c h e m i c a ls t r u c t u r e so ft h e s ed y e sa r es t a b l e e n o u g ha n dm a k et h e m o f c a r c i n o g e n c i t y , t e r a t o g e n i c i t ya n dm u t a g e n e s i s A st h ec o s t so ft r a d i t i o n a lt r e a t m e n tm e a s u r e sa r eh i g l la n dl e
10、 s s e c o - - f r i e n d l y , m e a s u r e so fb i o d e g r a d a t i o na n db i o - a d s o r p t i o nt od y e sa r er e c e i v e dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o ni nt h ea r e ao fe n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n T h i st h e s i sf o c u so ns t u d y i n go ft h ed e g r
11、 a d a t i o n o fa n i l i n eb l u e ，as u l f o n a t e dh i g hm o l e c u l a rw e i g h tt r i p h e n y l m e t h a n ed y e ，b y & o n e i d e n s i sM R 一1 s t r a i n M o r e o v e r , i n d e p t hs t u d yo fi t sd e g r a d a t i o nm e c h a n i s mW a sa l s ol i s t e d M e a n w h i
12、 l e ，a r e s e a r c hi nd e g r a d a t i o no fa n i l i n eb l u eb yc o m b i n e da p p l y i n gS o n e i d e n s i sM R - 1a n dn a n o m a t e r i a lW a sc o n d u c t e d T h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) R e s e a r c ho ft h eb e h a v i o ro fd e c l o r i z a t i
13、o n ，d e g r a d a t i o na n dd e t o x i f yo fa n i l i n eb l u eb yS o n e i d e n s i sM R - 1 T h ee f f e c t so fd i f f e r e n tf a c t o r st ot h ed e c o l o r i z a t i o n ，f o ri n s t a n c e ，i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，p H ，e l e c t r o nd o n
14、 o r sa n ds a l i n i t yW a ss t u d i e d R e s u l t ss h o w e dt h a t & o n e i d e n s i sM R - 1W a so fh i g ha b i l i t yo fd e c o l o r i z i n ga n i l i n eb l u e E v e n10 0 0m La n i l i n eb l u e c o u l db ed e c o l o r i z e dt o2 0 w i t h i n9 6h T h eh i g h e s td e c o l
15、 o r i z a t i o nr a t eo fa n i l i n eb l u eW a s h a p p e n e di nt h ep Hv a l u eo f7 0a n dt e m p e r a t u r eo f3 0 0 C B o t hl a c t a t ea n df o r m a t ew e r eg o o d c a n d i d a t eo fe l e c t r o nd o n o rf o rt h ed e c o l o r i z a t i o no fa n i l i n eb l u eb yS o n e
16、i d e n s i sM R 一1 S u r p r i s i n g l y , e v e n t oaN a C lc o n c e n t r a t i o no f8 0g L ，& o n e i d e n s i sM R - 1s t i l ls h o w e das i g n i f i c a n t d e c o l o r i z a t i o na c t i v i t y R e s u l t so ft h ec h e m i c a la n a l y s i so fd e c o l o r i z a t i o np r
17、o d u c ta n dt h e a d s o r p t i o ne x p e r i m e n ts h o w e dt h a td e c o l o r i z a t i o no fa n i l i n eb l u eW a sa b e h a v i o ro fd e g r a d a t i o n ， r a t h e rt h a na d s o r p t i o n M o r e o v e r , t h ep h y t o t o x i c i t ya n dc e l lg e n o t o x i c i t yo fa
18、 n i l i n eb l u es o l u t i o n a n di t sd e c o l o r i z a t i o np r o d u c t sW a se v a l u a t e d R e s u l t ss h o w e dt h a t & o n e i d e n s i sM R - 1c o u l d d e t o x i f ya n i l i n eb l u ei nt h ed e c o l o r i z a t i o np r o c e s s ( 2 ) R e s e a r c ho fb i o m e c
19、h a n i s mo ft h ed e c o l o r i z a i t i o no fa n i l i n eb l u eb y & o n e i d e n s i sM R - 1 A nu n u s u a lM t re l e c t r o nt r a n s f e rp a t h w a yW a st a k e ni nt h ea n a e r o b i cr e d u c t i o no fa n i l i n eb l u e L o s so fm t r C o m c As l i g h t l yi n h i b i
20、t e dt h er e m o v a lo fa n i l i n eb l u eb yM R - 1 O t h e r w i s e ，A m t r Ao r A m t r Bs h o w e dd e c o l o r i z a t i o ne f f i c i e n c yo fl e s st h a n7 0 a f t e r5 4 - hi n c u b a t i o n ，r e s p e c t i v e l y ， c o m p a r e dw i t ht h ew i d et y p e T oo u rs u r p r i
21、 s e ，t h er e m o v a la b i l i t yo fA e y m As t i l lk e p tah i 曲l e v e l w h i c hc o m p a r e dw i t hM R 一1w i t h i n5 4 一hd e c o l o r i z a t i o np r o c e s s M o r et h a t9 2 o fa n i l i n eb l u e ( 5 0 m g L ) W a sd e g r a d e di n4 8h w h e nn oo t h e re l e c t r o na c c
22、e p t o r sw e r ea d d e d D o s eo fD M S Os l i 曲t l y d e c r e a s e dd e c o l o r i z a t i o n ，w h i l ea d d i t i o no fn i t r a t e ，h y d r o u sf e r r i co x i d eo rT M A Os i g n i f i c a n t l y I I I 产电细菌S h e w a n e l l ao n e i d e n s i sM R - 1 对磺化三苯甲烷染料苯胺蓝的脱色降解及其机制研究 i n h
23、 i b i t e dt h ed e c o l o r i z a t i o no fa n i l i n eb l u e O t h e r w i s e ，a d d i t i o no fe l e c t r o nm e d i ac o u l di m p r o v e t h es p e e do fa n i l i n ed e c o l o r i z a t i o n A g s p D ，w h i c hl o s et h ek e yc o m p o n e n to ft h et y p eI Is e c r e t i o n
24、s y s t e m ( G S P D ) i nS h e w a n e l l a ，a l s oe x h i b i t e dr e d u c e dp e r f o r m a n c eo fa n i l i n eb l u er e d u c t i o n T h i s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e c o l o r i z a t i o na n dd e g r a d a t i o no fa n i l i n eb l u ew a sae x t r a c e l l u l a rr
25、e d u c i n g p r o c e s sv i ae l e c t r o nt r a n s f e ra c r o s sm e m b r a n e ( 3 ) E x p l o r a t o r yr e s e a r c ho fa n i l i n ed e g r a d a t i o nb yn a n o T i 0 2a n dS o n e i d e n s i sM R 1 U n d e r a n a e r o b i cc o n d i t i o n s ，t h ed e g r a d a t i o nr a t eo
26、 fa n i l i n eb l u eb yn a n o T i 0 2c o u l d r e a c ht o6 5 i nt h e l i g h t A f t e rd o s eo fn a n o T i 0 2a n d & o n e i d e n s i sM R 1 t h ed e g r a d a t i o no fa n i l i n eb l u ew i t h i n3 6h W a s1 3 h i g h e rt h a nt h a tb y o n e i d e n s i sM R I ( 4 ) N a n o T i 0
27、2e f f e c t i v e l yp r o m o t e dt h ec o n j u g a t i v ee f f e c to fS o n e i d e n s i sM R 1 N a n o T i 0 2 c o u l de f f e c t i v e l yp r o m o t et h ec o n j u g a t i v ee f f e c tt om o r et h a n10t i m e s I np r a c t i c a la p p l i c a t i o n ， t h ef i n a lc o n c e n t
28、 r a t i o na n dt h ea v e r a g ed i a m e t e ro f n a n o T i 0 2s h o u l d b e0 5m M a n d2 5n l n T h i st h e s i si n t r o d u c e st h ed e c o l o r i z a t i o n o fs u l f o n a t e d h i g hm o l e c u l a rw e i g h t t r i p h e n y l m e t h a n ed y eb yu s i n gm e t a lr e d u c
29、 t i o nb a c t e r i u mSo n e i d e n s i sM R 1 a n da l s or a i s e st h e a t t e n t i o nt ot h eb i o d e g r a d a t i o nm e c h a n i s m ，w h i c hp r o v i d e sa l li n d e p t hs u p p l e m e n tt ot h er e s e a r c h o nd e g r a d a t i o no ft r i p h e n y l m e t h a n ed y e
30、b yS h e w a n e l l ag e n u s K e yw o r d s ：A n a e r o b i cd e c o l o r i z a t i o n ，B i o l o g ym e c h e n i s m ，A n i l i n eb l u e ，S h e w a n e l l ao n e i d e n s i s M R - 1 ，N a n o T i 0 2 I V 江苏大学硕士学位论文 目录 摘 要一I A b s t r a c t H I 目勇匙一V 第一章绪论1 1 1 引言一1 1 2 三苯甲烷染料及其处理方法。1 1 2
31、 1 三苯甲烷染料简介1 1 2 2 三苯甲烷染料的物化处理3 1 2 - 3 三苯甲烷染料的微生物处理3 1 - 3S h e w a n e l l a 菌属脱色降解染料机制的研究发展概述8 1 4 本研究的背景、主要内容及意义一9 1 4 1 研究背景9 1 4 2 研究内容10 1 4 3 研究意义10 第二章& o n e i d e n s i sM R - 1 对苯胺蓝的厌氧脱色降解研究1 3 2 1 材料与方法1 3 2 1 1 菌种、培养基1 3 2 1 2So n e i d e n s i sM R 1 对苯胺蓝的脱色降解试验1 4 2 1 3 不同理化因子对于染料脱色率
32、的作用1 5 2 1 4 毒性评估1 5 2 2 实验结果16 2 2 1So n e i d e n s i sM R 1 对苯胺蓝的脱色降解行为1 6 2 2 2 苯胺蓝初始浓度对脱色降解的影响2 0 2 2 3 温度对苯胺蓝脱色降解的影响2 0 2 2 4p H 对苯胺蓝脱色降解的影响2 1 2 2 5 不同盐浓度下苯胺蓝脱色降解率的变化2 2 2 2 6 不同电子供体对于苯胺蓝脱色降解率的影响2 2 2 2 7 苯胺蓝及其降解产物的毒性评估2 3 2 3 讨论2 4 第三章& o n e i d e n s i sM R 1 对苯胺蓝的降解机制研究2 7 3 1 材料与方法2 8 3
33、1 1 菌株、质粒与培养条件2 8 V 产电细菌S h e w a n e l l ao n e i d e n s i sM R - 1 对磺化三苯甲烷染料苯胺蓝的脱色降解及其机制研究 3 1 2 试剂与药品2 9 3 1 3c y m A 基因回补实验2 9 3 1 4So n e i d e n s i sM R - 1 电子路径探索一3 2 3 1 5 不同电子受体对苯胺蓝降解的影响静3 3 3 1 6 电子介质对苯胺蓝降解效果的影响3 3 3 2 实验结果3 3 3 2 1c y m 4 回补菌株构建3 3 3 2 2 o n e i d e n s i sM R - 1 野生型与突
34、变体对苯胺蓝的脱色降解一3 4 3 2 3c y m A 缺失菌株与回补菌株对于苯胺蓝的降解3 5 3 2 4 电子受体或电子介质对苯胺蓝降解的影响3 6 3 3 讨论一3 7 第四章纳米氧化钛与So n e i d e n s i sM R - 1 联合降解苯胺蓝研究4 1 4 1 材料与方法4 1 4 1 1 菌株与培养条件4 1 4 1 2 纳米氧化钛悬浮液的制备4 1 4 1 3 纳米氧化钛与细菌联合脱色苯胺蓝体系4 1 4 2 实验结果_ 4 2 4 2 1 纳米氧化钛对苯胺蓝的脱色4 2 4 2 2 纳米氧化钛与o n e i d e n s i sM R 1 联合脱色苯胺蓝4 2
35、 4 3 讨 念4 3 第五章一种提高改良的S h e w a n e l l ao n e i d e n s i sM R 1 遗传转化的方法4 5 5 1 材料与方法4 5 5 1 1 菌株、质粒与培养条件4 5 5 1 3 受体菌& o n e i d e n s i sM R 1 的制备4 5 5 1 4 纳米二氧化钛悬浮液的制备4 6 5 1 5 纳二米氧化钛作用于细菌接合转化体系4 6 5 2 实验结果4 6 5 2 1 纳米氧化钛抗性质粒转化效率的影响4 6 5 2 2 纳米材料平均粒径对抗性质粒转化效率的影响4 7 5 3 寸 念4 8 第六章结论与展望4 9 6 1 全文主
36、要结论4 9 V I 江苏大学硕士学位论文 6 2 本文的不足与展望4 9 参考文献51 致谢5 5 在学期间发表的学术论文及其他科研成果5 7 附录A 实验仪器5 9 附录B 化学试剂6 0 V I I 江苏大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章绪论 水资源是整个地球生态系统中最具活力的构成因素，是人类生产和生活所不可缺少的重 要组成部分。现阶段我国己探明的常年性水资源总储量己达到了2 8 l 万亿m 3 ，社会大众年 总用水量在5 5 0 0 亿m 3 左右，居民的用水需求大体上可以得到满足。然而就我国而言，受到 人口众多因素的影响，我国现阶段水资源的人均占有量远低于世界人均占有量水平，丰
37、富 的水资源总储量并没有改变我国“水资源紧缺”国家的发展局面【1 】。更加值得注意的是，随着 我国工业化不断发展和城市化进程的迅猛推进，水资源分布不均匀以及水质恶化现象愈发严 重，这与现阶段我国经济社会发展的需求又形成了十分深刻的矛盾，转而阻碍了我国的现代 化发展进程。因此，对于环境保护研究人员而言，应当时刻以科学发展观指导自身实践，以 研究和开发高效废水处理方法为己任，并提出促进清洁生产的有效措施，为水资源的保护和 循环利用贡献力量。 近年来，随着印染行业的迅猛发展，染料制备工业以及相关染料的使用也迅速发展起来。 现阶段，我国染料年产量达到了7 0 万t ，其中有1 0 2 0 的染料流入到
38、废水中 2 】。当前印 染工业中使用的染料有许多不同的种类。按染料分子中相同的基本化学结构或共同的基团以 及染料共同合成方法和性质分类可分为蒽醌染料、偶氮染料、三苯甲烷类染料、靛族染料、 硫化染料、酞菁染料、杂环染料、醌亚胺染料、金属复合类染料、硝基染料等。目前印染行 业所使用的染料基本上是人工化学合成染料，其广泛应用来自于其品种繁多、结构复杂、化 学稳定性好、难以脱色等性质。然而这些性质致使染料难以被传统方法有效去除，且其中许 多染料具有一定的生态毒性3 - 6 1 和致癌、致畸、致突变“三致效应【7 西 ，因此成为了重要的污 染源。 1 2 三苯甲烷染料及其处理方法 1 2 1 三苯甲烷染
39、料简介 三苯甲烷染料是三大人工合成染料家族之一，被广泛应用于各种工业用途，如：纺织工 业的染色，药物和食品的染色以及造纸染色等等。其中在纺织工业中的应用最为广泛，如尼 龙，腈纶，棉制品，丝绸以及羊毛制品的染色【1 0 】。 l 产电细菌S h e w a n e l l ao n e i d e n s i sM R - 1 对磺化三苯甲烷染料苯胺蓝的脱色降解及其机制研究 三苯甲烷染料是以三苯甲烷为母体结构的一类染料( 如图1 1 所示) 。它是最早生产的 合成染料之一。根据苯环上取代基的不同分为：具有氨基的、具有磺酸基的和具有羟基的三 苯甲烷染料。根据染色方法和染色对象不同，又可分为酸性和碱
40、性三苯甲烷染料。 R 1 R 2 R 生 图1 1 三苯甲烷染料骨架结构( R 1 、R 2 、R 3 分别代表不同的取代结构) F i g u r e1 1T h es k e l e t o ns t r u c t u r eo ft r i p h e n y l m e t h a n ed y e 该类染料具有顽抗的化学结构，生化比B O D C O D 较低，可生化性不好，一般的生物降 解措施很难对其进行有效处理。传统的废水处理措施只适用于处理非异型生物质成分，而对 于像三苯甲烷染料这样的异型生物质分子很难有很好的效果。迄今为止，人们在染料废水处 理方向上的研究已有了很丰富的经验
41、，染料废水处理措施层出不穷( 表1 1 ) 。在此基础上， 进一步寻找满足处理成本低、处理效果好以及不会造成次级污染等要求的方法，已成为现阶 段染料降解研究最关键的课题。 表1 1 染料废水的一些处理措施 1 1 T a b l e1 1M e t h o d so ft h et r e a t m e n to fd y ew a s t e w a t e r 2 江苏大学硕士学位论文 1 2 2 三苯甲烷染料的物化处理 国内外对印染废水的处理方法有许多研究。针对不同的废水可以采用一种或多种方法联 用进行处理，处理方法的选择主要依据需要处理达到的要求和技术经济性，既要技术上可行， 也要经
42、济上合理。 d eOM a r t i n s 等人【1 2 】曾利用臭氧对孔雀石绿进行强氧化处理，达到了很好的消耗C O D 和脱色效果，然而这种强氧化反应措施的机理并不明确。P o r t e r 和S p e a r s ”1 报道过将三苯 甲烷染料进行光催化脱色的方法。此外也有报道，孔雀石在光反应中能够转化成4 二甲氨基 二苯甲酮和p - - 甲氨基酚【1 4 ；而结晶紫能够在光反应下，被转化成p _ - - 甲氨基酚，4 ，4 偏 二甲氨基二苯甲酮等产物【15 1 。此外，利用芬顿工艺 1 6 】和活性炭吸附工艺等物理化学方法 来降解或脱色染料也具有一定的效果。 包括三苯甲烷染料废水在内，虽然种类繁多的物理化学方法都被证实能够有效地处理染 料废水。然而并没有一种方法能够避免一个通病，那就是会生成大量的泥渣【l0 1 。此外，物理 化学方法在对染料废水的脱色能力、