叶籽银杏变异特性分析.pdf

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1、 符号说明 g: Gram,克 mL: Milliliter,毫升 L: Liter,升 d :Day,天 h:Hour,小时 min: Minute,分钟 cm: Centimeter,厘米 mm: Millimeter,毫米 m: Micrometer,微米 mol :Mole,摩尔 L: long chromosome,长染色体 M2: Medium-long chromosome,中长染色体 M1: Medium-short chromosome,中短染色体 S :short chromosome,短染色体 M: Metacentric chromosome,中部着丝粒染色体 Sm:

2、Submetacentric chromosome,近中部着丝粒染色体 St: Subterminal chromosome,近端部着丝粒染色体 T: Telocentric chromosome,端部着丝粒染色 Cav:Cavity,空腔 Col: Collar,珠领 II :Inner Integument,内珠被 IN: Iintegument,珠被 MI: Middle integument,中种皮 OI :Outer integument,外种皮 OV: Ovule,胚珠 SC: Secretory cavity,分泌腔 R: Ridge,突起 SH: Shrinkage,褶皱 CO

3、 :Conoid,“锥状体” 学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导 师 签 名： 日 期：

4、叶籽银杏变异特性分析 4 1 引言引言 银杏(Ginkgo biloba L. )，又名白果，公孙树，鸭脚等(沈林，1996)，在枕头记 中记录：银杏，在地球上已存在了一亿五千万年，其寿命之长居各植物之首，被科学家 称为“植物活化石”。银杏是中国的特种植物，70%的资源分布于中国，目前我国的银 杏资源居世界首位。银杏属于亚门银杏纲银杏科(Ginkgoaceae) 单种属银杏属(Ginkgo) 植物，雌雄异株，是第四纪冰川之后保存下来的一孑遗物种，在古植物学、植物分类学、 植物比较形态学、植物解剖学、胚胎学及果树栽培学等方面具有很高科研价值。属国家 二级保护的稀有植物。另外，银杏兼药用、果用、观

5、赏及用材于一体，现在，很多国家 的公园或道路两侧，常可看到银杏树，已成为美化环境、绿化庭院的理想树种，是一个 品质优良的多功能树种。叶籽银杏作为银杏资源中一个极为奇特的种质，以其具有的重 要观赏和学术价值近些年来受到国内外许多学者的高度关注。 1.1 银杏的起源和演化银杏的起源和演化 现代银杏成熟叶子的化石最早在中生代的下三叠纪地层中见到， 上三叠纪与侏罗纪 时，银杏已经分布到地球各处，十分繁茂。到了侏罗纪末期，逐渐衰落，最后只在中国 留存下来。所以银杏被许多植物学家称之为“活化石”（王伏雄等，1983；李正理等， 1959；郑万钧，1978；Favre-duchartre，1956）。目前公

6、认的可靠银杏属化石最早可以 溯到 1.8 亿年前的早侏罗纪（Tralau，1967；周志炎等，2003）。到现在关于银杏的起 源和演化问题还不是十分清楚。存在的一些论述，也多是根据化石植物的印痕和所出现 的地质年代，经过分析比较之后得出的一些初步结论。另外，由于银杏类植物化石多数 仅有叶部形态，生殖器官除花粉之外，极少见有保存。所以有关银杏起源和演化还没有 得到确切的结论。 许多植物学家和学者认为， 银杏类植物的发生始自距今 2. 83. 5 亿年的古生代时期 的上石炭纪，可能由苛得狄目(Cordaitales)演进而成，或与之同源。根据对化石资料的研 究来看，侏罗纪至白垩纪时期的银杏类植物至

7、少有 20 余属 150 余种，其中在我国发现 的就有 10 多个属 100 多个种（曹福亮等，2002）。经侏罗纪到早白垩纪的繁盛期后， 到了白垩纪晚期，地球的气候变得干冷，便出现了高度进化且适应性强的被子植物，银 杏类植物开始衰败。经过第四纪冰川运动，气候剧变，地球上的大部分地区银杏类植物 灭绝(林协，1965)。银杏属的种急剧减少，至上新世以后仅存 Ginkgo biloba 一种（周志 炎等，2003；Zhou et al.，2006；邓胜徽等，2004）。 山东农业大学硕士学位论文 5 石炭纪出现的二歧叶属(Dichophyllum) 是银杏类最古老的代表，它的营养枝及木质 部与银杏

8、目极为相似，叶也呈扇形，但无叶柄，形状好像经过多次深裂的银杏叶。比较 可靠的银杏类化石是早二叠纪的毛状叶属(Trichopitys)， 其叶子比二歧叶属更细长， 球果 (胚珠) 生长在自叶腋生出的分枝上，与当今银杏胚珠的着生部位完全不同（李星学等， 1981）。 到了中生代时期，包括银杏类在内的裸子植物组成了浩瀚的森林，覆盖着大地。根 据叶部化石研究得知，二叠纪出现的楔银杏属(Sphenobaiera) 和现代银杏不同之处主要 是不具明显的叶柄。从晚三叠纪起，已存在和银杏相当近似的种，如似银杏属 ( Ginkgoites) 、拜拉属( Baiera) 等在地球上已有广泛地分布。中生代侏罗纪是银

9、杏目的 “黄金时代”，中生代银杏目中除银杏属外，至少还有 14 个属，如拜拉属(Baiera) 、准 银杏属(Ginkgodium) 、 楔拜拉属(Phenobaiera)等， 银杏属中有20 多个种(李星学等， 1981； 周志炎，1990)。白垩纪晚期，气候急剧变化，银杏类植物开始衰落，到第三纪末期第 四纪初冰川运动，地质条件变迁，银杏仅在中国得以幸存。根据化石资料以及从它的亲 缘关系和进化历史追溯，现代生存的银杏极有可能是由古生代二叠纪唯一孑遗种的延 续。 周志炎院士运用古植物整体重建、分支系统学、异时发育以及透射电镜和超薄切片 等方法，深入研究了义马侏罗纪的银杏目植物化石。发现目前世界

10、上最古老和最完整的 银杏属化石义马银杏及义马果， 阐明了银杏目大孢子膜发育后期的超微结构变化规 律，探讨了银杏目起源、系统发育和进化趋式，并提出了新的银杏目分类方案(周志炎， 1990，1992，1994；Zhou ，Zhen，2003；Zhou ，Wu，2006)。这些研究的进行为银杏 的起源和演化提供了重要的理论依据。 1.2 叶籽银杏的概述叶籽银杏的概述 1.2.1 叶籽银杏的分布 1891 年， Shirai 在日本的山梨县发现世界上第一株叶籽银杏(Sakisaka， 1929； Soma， 1999) 翌年， Fujii 发现第二株叶籽银杏， 同时还发现了叶缘生小孢子囊 （micro

11、sporangia） 的雄树（Sakisaka，1927；Soma，1999）以后，在日本的宫城、山形、爱知等 10 余个 县共发现叶籽银杏 11 株（邢世岩等，2004）此外，全球共计发现叶生小孢子囊银杏 3 株，其中日本 2 株（Soma，2001），中国 1 株（邢世岩等，2007）。目前，日本已报道 叶籽银杏变异特性分析 6 25 株叶籽银杏，其树龄为 501200 年。然而，直到 20 世纪 60 年代初在欧洲和美洲均没 有发现叶籽银杏的报道（Li，1961）。1961 年，美国从日本引种叶籽银杏，栽植在宾夕 法尼亚州的 Longwood 公园（邢世岩等，2004）。 1984 年，

12、郭善基报道了在山东省沂源县发现的我国第一株叶籽银杏(郭善基等， 1984)，此后，在我国的广西、福建、山西、陕西、湖北、四川、湖南、广东和甘肃相 继发现叶籽银杏（邓荫伟等，1989；彭日三，1995；吴圣地等，1999；周良才等，1996； 邢世岩等，2004）。 我国目前已发现 32 株叶籽银杏，树龄为 201 000 余年不等（邢世 岩等，1993；1997；2004；李士美等，2007）。 1.2.2 叶籽银杏的分类地位 1712 年，Kamepfer 首次确定了银杏的属名 Ginkgo，1771 年 Linnaeus 根据 Kaempfer 的形态描述和所采标本，正式命名了银杏的种名

13、Ginkgo biloba L. (邢世岩等， 1996； 2004) 。此后，国内外诸多学者对银杏的分类地位进行了研究。由于银杏属与 榧树属( Torreya) 和三尖杉属( Cephalotaxus) 成熟种子的相似性，曾将银杏归为红豆杉 科(Taxaceae) (Favre-Duchartre ，1958)。1896 年，日本学者平濑作五郎(Hirase) 发现银 杏具有能游动的鞭毛精子(spermatozoid)，使得银杏从紫杉科中分离出来，单独成立银杏 目， 现代银杏则是银杏目植物仅存的代表植物(Hirase， 1896 ； Foster et al . ， 1983) 。 法 国的

14、 Carriere 于 1867 年、德国的 Beissner 于 1887 年、英国的 Henry 于 1906 年等对 银杏种级以下分类进行了研究；将其分为 aurea , f astigiata , pendula , laciniata , variegata 等多个变种(var. ) ， 已被一些学者引用(郭善基， 1993 ； 邢世岩， 1993； 邢世岩等， 2004) 。 中国银杏品种的分类主要依据种子的形状、 质量和大小。 1935 年曾勉在浙江诸暨作了银 杏调查之后，按栽培植物命名法将银杏的栽培品种划分成三大类梅核银杏类、佛手银杏 类、马铃银杏类（曾勉，1935）。1966

15、 年，英国植物学家赫尔逊根据国际栽培植物命 名法规 对品种(栽培变种)所下的定义将银杏的这些变异类型全部划归为品种等级。 1978 年，中国植物志第 7 卷，将银杏种级之下的所有变异类型也均列入品种等级(郭善 基等，1997)。 1891 年，Sharai 最早发现了叶片上生胚珠的叶籽银杏。翌年，Fujii 发现第二株叶籽 银杏和叶缘生小孢子囊的银杏叶生小孢子囊银杏。但是直到 1927 年日本植物分类 学家 Makino （牧野富太郎） 首次把叶籽银杏定为一个变种： Ginkgo biloba L.var.epiphylla 山东农业大学硕士学位论文 7 Mak.，并被后人引用（吉冈金市，19

16、67；郭善基等，1984；彭日三，1995）。在前人工 作的基础上，胡先骕（1954）把银杏分为 7 个变种（var.），叶籽银杏被列为 7 个变种 之一。但是，从整株树上看，叶籽银杏的叶生胚珠（种子）约占全树胚珠（种子）数目 的 525（吉冈金市，1967；邢世岩，1993；彭日三，1995；周良才等，1996），而 且有交替结实习性（周良才等，1996），因此，有人认为银杏不具有变种的条件，只不 过是银杏的个别返祖现象（彭日三，1995）。1966 年，Harrison 按照国际栽培植物命 名法 规定将已命名的金叶银杏 （Ginkgo biloba var. aurea） 、 塔形银杏(G

17、inkgo biloba var. fastigiata)、裂叶银杏(Ginkgo biloba var. laciniata)、垂枝银杏(Ginkgo biloba var. pendula) 和斑叶银杏(Ginkgo biloba var. variegata) 5 个变种（var.）改称为品种（cv.），这种分类 方法被一些学者引用（郭善基，1993；邢世岩，2004；邢世岩等，2004）。但是，叶籽 银杏未列在其中。郑万钧等（1978）在中国植物志第七卷正式明确了银杏种级之下 无变种和变型，全部为银杏品种的分类方法。然而，郑万钧(1983)在中国树木志第 一卷所描写的中国洞庭皇(Gin

18、kgo biloba cv. Dongtinghuang)等 12 个银杏主要栽培品 种中也没有提到叶籽银杏。美国著名育种学家 Santamour 等（1983）也将叶籽银杏列为 一个品种。然而，叶籽银杏树上的种子有几种不同类型，种核也有多种类型，且叶生种 子仅占少数(郭善基等，1984；彭日三，1995；邢世岩等，1997；黄明，1997)，将叶籽 银杏列为一个品种也不是十分恰当。有些学者则根据种核形态特征，将叶籽银杏作为一 个品种列入长子类 （long stone type） （郭善基等， 1993； 龙兴桂等， 2000； 陈鹏等， 2004） 。 彭日三（1995）则主张以叶籽银杏的特

19、殊形态命名，将叶籽银杏命名为 Ginkgo biloba L. cv. Yeziyinxing。吉冈金市(1967)认为叶籽银杏属于环境型（f.），即银杏的学名应该 是 Ginkgo biloba f. epiphylla。 由于叶生小孢子囊银杏和叶籽银杏在表现形式和本质上的一致性，一个为雄株，一 个为雌株。因此，二者应该采用相同的命名，并具有同等的分类学地位。 1.2.3 叶籽银杏的形态学与解剖学研究 自叶籽银杏发现以来，研究主要集中在叶籽银杏的形态学观察，在日本，4 月上旬， 叶籽银杏芽开始舒展前，有些叶片叶缘开始出现细长的白色脊状突起（ridge），突起部 分叶肉细胞比较疏松。随着叶子的

20、生长，突起继续膨大如虫瘿状，继而出现叶生胚珠雏 形（Sakisaka，1927，1929；Soma，1999）。Soma(1999)发现叶生胚珠也存在珠孔 叶籽银杏变异特性分析 8 （micropyle），然而珠孔下部的细胞没有发生细胞退化，从而不能形成花粉室（pollen chamber），也不能产生传粉滴（pollination drop）。然而，彭日三（1995）报道有可能 长成叶生种子的叶生胚珠在授粉期间同样出现“授粉滴”。正常银杏种子发育成熟时， 产生叶生种子的叶的一半叶片皱缩成类似被子植物“花萼”，紧贴种子，种子大小明显 较正常银杏小（郭善基等，1984；彭日三，1995）。Som

21、a（1999）研究发现叶籽银杏的 发生具有异时性，秋季仍见叶籽银杏的有些叶片上尚有白色脊状突起，而李士美等 （2007）研究时发现叶籽银杏还具有滞后性的特点。 20 世纪末， 叶籽银杏研究有一项重要发现， 日本的 Soma 研究叶籽银杏时次发现叶 籽银杏叶生胚珠也有颈卵器(archegonium)，而且叶生胚珠颈卵器的位置与正常胚珠明显 不同(Soma，1999) 。正常胚珠的 2 个颈卵器分居于雌配子体表面帐篷柱(tent pole) 的 两侧(Lee ，955) ，也有报道有 4 个颈卵器(李正理，1959)，有时多达 6 个(吉成均等， 2003) ，而叶生胚珠的 2 个颈卵器一上一下紧

22、连，且在受精前退化，因而，不可能进行 受精，这可能也是叶生种子无胚的另一原因。正常胚珠发育过程中颈卵器退化的现象也 有报道(吉成均等，2003；马清温，2000) 。姚林梅（2010）研究叶籽银杏叶生雌性生殖 器官时也发现颈卵器，并且颈卵器数量不确定、位置不确定。叶籽银杏叶生雌性生殖器 官一般具有 13 个颈卵器，通常是 1 个，少数叶生雌性生殖器官有 23 个颈卵器，在研 究的过程中只发现了 2 个叶生种子具有 3 个颈卵器， 所以叶籽银杏叶生雌性生殖器官的 颈卵器具有数目不确定性的特定；叶籽银杏叶生雌性生殖器官的颈卵器的着生位置有： 珠孔端、珠孔端下方一侧、合点端、合点端上方一侧，因此说叶

23、籽银杏叶生雌性生殖器 官的颈卵器具有位置不确定性的特性； 具有 1 个以上颈卵器的叶籽银杏它的颈卵器都是 分散排列，颈卵器不连在一起；颈卵器的颈细胞通常不明显。研究过程中并没有发现颈 卵器的退化； 叶籽银杏叶生雌性生殖器官颈卵器和银杏正常颈卵器的区别是着生位置和 结构不同，叶生雌性生殖器官通常没有明显的颈细胞和腹沟细胞。1892 年，在 Fujii 发 现世界上第 2 株叶籽银杏的同时， 还发现了具有叶生小孢子叶球的叶籽银杏， 至今仅发 现 2 株(Soma，1999 ；2000) 。为获得 2 种叶籽银杏的杂交后代，Soma (2000 ；2001) 将叶生小孢子叶球的花粉在正常胚珠内进行活

24、体培养直到形成囊状的花粉管时， 将其剥 离后和具颈卵器的叶生胚珠的雌配子体进行结合培养，然而，试验未获得成功，但是 Soma 的试验对以后的叶籽银杏的实验形态学研究具有借鉴作用。 史继孔（1998）根据对银杏雌花芽纵、横切面的观察，将银杏雌花芽形态划分为 6 个时期， 即： 未分化期、 分化盛期、 珠被分化期、 珠心分化期和珠托分化期。 王莉 （2007） 山东农业大学硕士学位论文 9 研究发现银杏授粉后 2 d 胚珠已分化出珠心、珠被和珠托组织，珠被顶端形成直径为 162.16m 的珠孔与 540.54m 长的珠孔道，珠心组织顶端形成长约 520.83m、 最大直径 约 125.06m 的瓶

25、状贮粉室，花粉粒经珠孔道已到达贮粉室并在其中停留；雌配子体的 发育先后经历了游离核阶段和细胞化阶段，之后在近珠孔端形成颈卵器，其余部分发育 为胚乳薄壁细胞，其营养物质的积累高峰期为授粉后 6080 d；种皮分化与形成分别经 历珠被分化期、种皮分化期、种皮形成初期、种皮形成期。 李士美等 （2007） 研究发现叶籽银杏叶生拟胚珠的发育过程可分为发端期、 形成期、 增大期和成熟期。每个叶上叶生拟胚珠 18 个，但只有一个能正常发育。叶籽银杏的 叶片可以分为多裂型、全缘型、二裂型、叶生拟胚珠叶和变形叶，叶色分绿色和斑叶两 种类型；与正常胚珠相比，首次发现叶生拟胚珠的数量和着生部位差异较大，发生时间

26、具滞后性和异时性。叶生拟胚珠的形成期比正常胚珠滞后 15 d，而且在授粉期的叶生拟 胚珠上始终未发现“传粉滴”的出现； 叶生拟胚珠按其着生位置分为单裂单生型、单 裂簇生型、双裂簇生型、多裂单生型和散生型 5 种； 叶籽银杏正常叶叶脉具有闭合型、 W 型、V +W 型和双 V +W 型的网结联合，而叶生拟胚珠叶的叶脉有单弧形、双弧形和 多弧形 3 种类型。 1.2.4 叶籽银杏的细胞学研究 核型的差异被广泛地用作确定植物间分类差别的依据。 染色体核型或组型分析是染 色体研究中的一个基本方法，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型，不同的物种 具有不同的核型，所以核型是区别物种的基本遗传学依据（刁

27、英，2004）。它对研究植 物系统演化，物种之间的亲缘关系、起源、进化与分类、远缘杂交及遗传工程中的染色 体鉴别都有重要意义（朱澂等，1982）。 核型分析是探讨植物亲缘关系和系统演化的一种有效方法(梁国鲁等，1999)， Ishikawa(1910)最早发现银杏染色体为 2n=24。Eichhorn(1928)首次报道了银杏染色体上 有随体， 并认为这可能与性别有关。 Sax(1933)首次绘制了银杏雌配子体染色体图。 Tanaka 等(1952)观察了雌雄株的染色体，但均未发现性染色体。Newcomer(1987)和 Lee(1954) 在各自研究中分别发现了雌雄株银杏染色体的差异。陈瑞阳

28、等以核型分析、C 带和 Ag-NOR 染色体技术对雌雄株进行研究，得出雄株简式为 2n=24=22A+ZZ，雌株简式为 2n=24=22A+WZ。 叶籽银杏的染色体核型分析表明， 叶籽银杏没有发生染色体倍性变化， 叶籽银杏变异特性分析 10 核型公式为 2 n = 2 x = 24 = 4m + 8sm + 12st 。然而，中国叶籽银杏的染色体相对长度组 成(relative length formula，RLF) 为 RLF = 3L + 2M2 + 2M1 + 5S，即有 3 对长染色体，2 对中长染色体，2 对中短染色体和 5 对短染色体，染色体长度比(length ratio) 较大

29、，而 日本的叶籽银杏 RLF = 1L + 6M2 + 4M1 + 1S，具有 1 对长染色体，6 对中长染色体，4 对中短染色体和 1 对短染色体，平均臂比(mean arm ratio) 较大。由此推断中国的叶籽 银杏较日本的更为原始(高进红等，2005)。邢世岩等(2007)对中国、法国、美国等地 21 个银杏特异种质进行了核型分析，认为中国的“叶籽银杏”比日本的“叶籽银杏”更原 始。 1.3 正常银杏胚珠的形态和结构研究正常银杏胚珠的形态和结构研究 1.3.1 银杏胚珠的形态结构 Foster 和 Gifford（1983）指出“胚珠是银杏的雌性生殖器官”。胚珠具有较叶柄短 的总柄，集

30、中于短枝顶部的叶簇，腋生。总柄顶端具有不明显的分叉，着生 1 对（偶有 34 个）胚珠，胚珠直立，基部包围一圈环状凸起，称为珠托。胚珠外边珠被包被珠心。 珠心上部与珠被分离形成珠孔，珠孔为环状或卵形。珠心下部与珠被无分界的区域称为 合点。在珠心中形成胚囊，即雌配子体。 1.3.2 胚珠的发育 银杏胚珠分化持续的时间较长。贵阳地区 6 月份，银杏枝条生长趋缓，银杏雌花芽 开始形态分化，持续到翌年 3 月完成。形态分化可分为 6 个时期：未分化期、分化始期、 分化盛期、珠被分化期、珠心分化期以及珠托分化期。一般 7-12 月为总柄分化期，珠 被分化期在 12 月中旬至 2 月上旬， 2 月中旬至

31、3 月上旬是珠心分化期 （史继孔等， 1998） 。 北京地区， 3 月中旬银杏胚珠开始发育， 此时已分化出珠心和珠被 （王伏雄等， 1983） 。 在幼小胚珠顶端有 2 个胚珠原基，随后胚珠原基便可突起。4 月中旬，珠托开始分化， 珠托由珠被基部的珠托原基发育而成。4 月底到 5 月初，短枝顶芽芽鳞张开，胚珠裸露 接受传粉（王伏雄等，1983；邢世岩等，1996）。当珠被原基出现后便围绕珠心扩展， 最终形成一个完整的环状组织。北京地区，6 月份当精原细胞到达珠心顶部时，珠被已 山东农业大学硕士学位论文 11 明显分化为 3 层细胞。1 个成熟的胚珠由珠心、珠被、珠托、合点端、珠孔端组成，其

32、内着生大孢子母细胞（邢世岩等，1996）。 早期的大孢子母细胞深位于珠心组织内，近球形，细胞核大，位居中央，细胞质浓 厚。随后，大孢子母细胞变长，细胞壁加厚，近珠孔端细胞质中出现一些大而复杂的内 质网系统。大孢子母细胞成熟时呈长椭圆形，珠孔端内质网非常丰富，呈环形或圆形， 质体、线粒体呈明显的极性分布(Konar，1980；吉成均等，1999；2003)。 银杏大孢子母细胞经减数分裂形成 34 个细胞，通常形成线性排列的四分体，但有 时也见其他排列方式的四分体。近珠孔的 23 个细胞退化，离珠孔最远的 1 个细胞发育 成功能大孢子 （邢世岩等， 1996） 。 这与该细胞更易吸收合点端的养分有

33、关 （Chamberlain， 1935）。大孢子形成的同时，珠孔端的一团细胞膨大后降解，形成贮粉室（曹福亮等， 2002），而贮粉室的形成是珠孔端珠心细胞程序化死亡过程（李大辉等，2002）。 根据对扬州地区银杏雌株物候期的观察，正常银杏胚珠于 4 月初开始发生，至 4 月 13 日大部分胚珠产生传粉滴， 通过对授粉后胚珠的结构进行形态解剖学观察发现授粉期 胚珠已分化出珠心、珠被和珠托组织，其中珠被原基围绕珠心外围逐渐扩展，并在珠心 上部围合形成珠孔道空腔，珠被的基部边缘突起形成珠托；珠孔的形状为近圆形，其开 口处的最大直径为 162.16m，细胞向下延伸形成珠孔道，从珠孔处至贮粉室开口处的

34、 珠孔道长约为 540.54m，直径约为 86.49m。珠孔与珠孔道的细胞形状均呈管状排列， 细胞壁光滑；珠心组织顶端细胞纵向伸长，形成一开口向上的空腔，其开口端正对珠孔 道，开口处仅由 1 层细胞组成，空腔形态为瓶状，即为贮粉室；珠被组织已明显增厚， 可分为珠被外区和珠被内区，其中珠被内区由大量的薄壁细胞组成，细胞核明显，而珠 被外区中分布着许多分泌腔原始细胞，这些细胞的细胞质浓，细胞壁厚，染色深，细胞 高度液泡化。在珠被外区的外围有些原始细胞正在形成分泌腔，其形状为圆形或椭圆形 空腔，外围由 23 层鞘细胞共同组成；珠托中分布有发育成熟的分泌腔和大量的原始细 胞，并通过维管组织与珠柄相连，

35、木质部管胞为螺纹管胞，维管组织的形成为胚珠的发 育提供了运输营养物质的通道。 Douglas（2007）对银杏胚珠的发育进行了观察。着生胚珠的珠柄发端于叶腋。每 个柄原基一分为二着生 2 个胚珠原基。珠被发育是周缘的，并且在珠孔形成的过程中有 点浅裂。初生珠心组织起源于下皮层的平周分裂。下皮层是珠心的顶层细胞，它在贮粉 室形成期间仍然保持分裂。一个孢子母细胞在孢子囊组织中分化。其它的细胞像绒毡层 一样分化。 表皮层对初生珠心的发育没有直接的影响， 但对次生珠心组织的发育有影响。 叶籽银杏变异特性分析 12 次生周缘组织根据它们的生长模式和在珠心中的位置分成不同的区域。 贮粉室有一个明 显的外壁

36、。珠孔端周缘组织包括远端组织和近端组织。合点端周缘组织位于扁平细胞层 和造孢组织之间。珠被和珠心分化后，靠近胚珠的下皮层细胞进行平周分裂形成珠领。 珠领是银杏特有的构造。在一些胚珠中，珠领和胚珠间的组织瓣也会发育。 银杏种皮主要由肉质外种皮、骨质中种皮和膜质内种皮组成。授粉后 3 d 银杏珠被 组织生长迅速，可分为珠被外区与内区，珠被外区分布有正在分化的分泌腔和大量的分 泌腔原始细胞团，珠被内区由薄壁细胞组成，细胞核明显。授粉后 30d，珠被组织中的 细胞开始分化，其中珠被外区发育为外种皮，外种皮中的分泌腔与分泌腔原始细胞集中 分布在表皮及表皮以下的几层细胞，分泌腔与分泌腔原始细胞的数量逐渐增

37、多，其余部 分为大量的薄壁细胞。珠被内区发育为中种皮，细胞排列整齐、紧密，细胞核变大，细 胞壁的增厚不明显。 授粉后 50 d 的外种皮分泌腔数量达到最多， 分泌腔的空腔达到最大， 分泌腔之间由 27 层薄壁细胞间隔开，薄壁细胞中仍分布有许多分泌腔原始细胞。中种 皮细胞排列致密，形成 1 条染色深的条带，其细胞壁增厚明显，细胞核体积变小，且大 多细胞核沿细胞壁排列（王莉等，2010）。孙霞等（2009）曾研究中种皮的超微结构的 比较发现正常种子的中种皮均是由管胞构成，管胞壁上具有明显的穿孔，为具缘纹孔。 就水分和养分来看，正常银杏雌配子体生长曲线为“S”型。雌配子体在受精之前 的一个重要生理现

38、象是淀粉、类脂及脂蛋白的积累。干重的增加在鲜重增加之后 2 个月 开始。但在受精之前，受精没有改变银杏雌配子体养分的积累（邢世岩等，1996）。 1.4 选题目的和意义选题目的和意义 叶籽银杏系银杏家族中一特异的种质，目前仅中国和日本对叶籽银杏有所报道。国 内外学者也对其分类地位从变种（var.）到品种（cv.）进行过讨论。具体说来叶籽银杏 的重要性主要在于：由于具有明显的叶生胚珠，形态上的特异性使其被视为很好的观赏 品种；由于其形态上的原始性，被用来作为研究银杏起源及系统发育的最佳试材；叶生 胚珠的形态发端和发生过程以及比较形态研究对银杏雌性生殖器官的本质研究具有重 要的系统学意义；叶籽银杏

39、在叶生胚珠、叶色、叶裂、叶脉、正常胚珠等方面具有多种 变异，选择优良的雄株，开展叶籽银杏杂交育种及子代测定，这对银杏核用、叶用、观 赏、材用品种选育有重要意义。 叶籽银杏发现以来，将叶籽银杏化为品种还是变种的问题一直没有确定，有些学者 根据种核形态特征， 将叶籽银杏作为一个品种列入长子类 （彭日三， 1995； 郭善基， 1993； 山东农业大学硕士学位论文 13 龙兴桂，2000；陈鹏，2004）。彭日三（1995）则主张以叶籽银杏的特殊形态命名，将 叶籽银杏命名为 Ginkgo biloba L. cv.Yeziyinxing；这说明叶籽银杏叶生种子的特殊形 态已得到人们的高度重视。以山东

40、沂源县发现的 5 株叶籽银杏叶生种子为试材，对其形 态学进行了较系统的研究，第一次对叶籽银杏在树体和叶片上的分布特征以及果实、种 皮的形态进行详细研究总结，对叶籽银杏的形态学和分类有一定的指导意义。 核型分析是探讨植物亲缘关系和系统演化的一种有效方法(梁国鲁，1999)。以山东、 日本等地的 28 个叶籽银杏种质为试材，对其染色体倍性及核型进行观察，通过染色体 水平的整体特征，研究和比较叶籽银杏的核型来判断和分析它们的亲缘关系和进化趋 势，为探讨叶籽银杏的分类地位及起源奠定细胞学基础。 以叶籽银杏叶生胚珠和正常银杏正常胚珠对照研究叶籽银杏的解剖结构变异， 因而 对叶籽银杏畸形发生的形态结构、

41、发育进行研究无疑有助于认识银杏雌性生殖器官的形 态学本质，以及银杏目的系统发育，更深入的了解银杏乃至裸子植物的演化适应与系统 发育。本研究对确定银杏这一古老类群的系统位置和亲缘关系也很有意义。 对叶籽银杏的变异特性进行研究探明其形态学、 染色体核型以及解剖结构的不同特 征，将对其分类和起源变异研究提供重要的理论支撑。 2 材料与方法材料与方法 2.1 试验地概况试验地概况 试验地设在沂源县仲庄镇和泰安老君堂，沂源县现在有7株叶籽银杏，沂源县地处 鲁中山区，沂蒙山区的北部。鲁山主峰海拔高度1108.3m，沂河河谷海拔180m，处于东 经117o48118o31；北纬35o5536o23。年平均气

42、温11.9oC，有效积温4017oC；平均年蒸 发量1886mm；无霜期189天。一年中四季分明，春季干旱且气候多变，45月份降雨较 频繁，夏季多雨温度高湿度大，秋季雨水少，冬季干燥寒冷，整个气候属于暖温带大陆 性气候。泰安市位于山东省中部，地处东经11602至11759、北纬3538至3628之间， 东西长约176.6公里，南北宽约93.5公里。属温带半湿润大陆性季风气候区，年平均气温 13,7 月份气温最高，平均26.4，1月份最低，平均-2.6。年平均降水量697 mm。境 内泰山海拔1545 m，具有明显的高山气候特征。山顶气温一般比山下常年低78，年 平均降水1106 mm。 叶籽银

43、杏变异特性分析 14 2.2 实验材料实验材料 本实验用于形态描述的材料（表1）为2008年采集的叶生成熟种子。用于染色体核 型分析的实验材料为来自日本、山东等地的28株叶籽银杏，取自山东农业大学叶籽银杏 种质资源基因库，共28个种质(表2)。用于解剖的主要实验材料为沂源县仲庄的一株叶籽 银杏，以泰安老君堂的正常银杏做对照（表1）；2009年3月开始观察树体发育情况；4 月18日进行第一次采样，4月18日至5月16日一周采样两次；5月23日至8月30日一周采样 一次；9月24日、10月12日各采样一次。采集树体上发育良好的正常胚珠和拟胚珠各58 个。 表 1 材料来源及特征 Table1 So

44、urce and characteristics of material 来源 树高/m 胸径/cm 冠幅/mm 树龄/a 沂源钟庄镇油坊 21.5 215.0 16.512.5 1300 沂源仲庄镇 15.0 114.0 20.022.0 700 沂源织女洞林场 25.0 102.2 20.516.3 800 沂源白峪 21.5 164.0 31.028.0 800 沂源辉村 18.0 89.0 13.013.0 800 泰安老君堂 20.7 119 15.514.8 1300 表 2 叶籽银杏种质的来源及形态指标 Table 2 Sources and morphological inde

45、xes of Ginkgo biloba var.epiphylla Mak. germplasms 标本号 来源 树高（/m） 胸径(/cm) 冠幅（mm） 树龄(/a) YZ1 沂源织女洞林场 1# 25.0 102.2 20.516.3 800 YZ2 沂源织女洞林场 2# 19.7 68.8 10.312.1 800 YZ3 沂源燕崖乡 21.5 164.0 31.028.0 800 YZ4 沂源燕崖乡 18.0 89.0 13.013.0 800 YZ5 沂源仲庄镇 15.0 114.0 20.022.0 700 YZ6 沂源仲庄镇油坊 21.5 215.0 16.512.5 130

46、0 YZ7 沂源荆山园艺场 22.7 165.0 26.027.0 800 SY1 YZ1 实生子代（表达） 19.0 45.0 15.012.0 40 SY2 YZ1 实生子代 （未表达） 20.0 47.0 11.018.0 40 NS1 肥城市牛山 1# 16.0 316.0 13.016.0 1000 NS2 肥城市牛山 2# 20.0 100.0 18.015.0 1000 山东农业大学硕士学位论文 15 TD 济南塘豆寺 20.0 160.0 20.024.0 1400 TC1 云南腾冲 13.5 102.0 5.06.0 300 TC2 云南腾冲 12.5 87.0 4.06.0

47、 300 TC3 云南腾冲 12.0 74.0 3.02.0 300 GX1 广西兴安 25.3 102.0 20.516.3 500 GX2 广西兴安 12.5 66.8 11.011.5 80 GX3 广西兴安 11.5 64.0 10.011.5 80 WC 四川旺苍 26.0 150.0 11.312.5 130 WY 四川万源 30.0 150.0 11.013.0 300 ZP 福建漳平 15.0 80.0 12.010.0 309 SM 福建三明 17.59 120.0 15.016.0 100 DZ 河南邓州 18.0 105.0 20.222.5 1000 HB 湖北安陆市

48、27.6 214.0 26.927.5 1040 SX 陕西白河 42.0 213.0 35.035.6 1500 DK 湖南洞口 18.0 50.0 9.610.3 50 TG 山西太谷 24.0 80.0 15.015.0 300 Oha 日本叶籽银杏引自法国 4.2 6.0 3.03.5 9 2.3 研究方法研究方法 2.3.1 叶生种子的形态描述 着生位置调查：统计叶片近轴面、远轴面的叶生胚珠数（图 1，C）；分别记录叶片九 个区面（a-i）的叶生胚珠数（图 1，D）。种子形态描述：采集的叶生种子用 70%酒精 保存，由外至内分层解剖，对叶生种子的果实、种核（图 1，E）、内种皮、种仁

49、进行 形态观察及研究；测定的指标有：种子的种重、长、宽和厚，种核的重、长、宽、厚和 出核率，种仁的重、长、宽、厚和出仁率；每个单株叶生种子 5 次重复；所获得的数据 采用软件 Excel 和 SAS 分析。 叶籽银杏变异特性分析 16 注：本文受精前称叶生胚珠，受精后称叶生种子。 Note：it is epiphyllus ovule before fertilization，it is epiphyllus seed after fertilization. 2.3.2 叶籽银杏核型分析 2.3.2.1 药品的配置药品的配置 实验所用溶液配方（李国珍等，1985）： (1) 饱和对二氯苯溶液的配制 称取5g结晶放入棕色试剂瓶中， 加入100ml已加热到4045的蒸馏水中， 振荡5min， 静置冷却（约1h）后即可使用。该溶液在1020条件下存放和处理为宜。溶液用完后， 可重新加入温热蒸馏水，如上法配制。 (2) 改良卡宝品红（Carbol fuchsin）染液的配制： 原液A：3克碱性品红溶于100ml体积分数70