文昌鱼4.1蛋白与血影蛋白、肌动蛋白结合活性中心的鉴定.pdf

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1、十目* # 目 n i 缩略语 A m p ( a m p i c i I l i n ) 氯, f - 青霉索 B j P 4 1H 本文吕鱼4 1 蛋白 B p ( b a s ep a i r )碱丛对 B S A ( b o v i n es e r u ma l b u m i n )牛血清白蛋白 E c o l i ( E s c h e r i c h i ac o l i )大肠杆菌 E D T A ( e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d l 乙二胺四乙酸 E L I S A ( e n z y m

2、 e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) 酶联免疫吸附 H f h o u r ) 小时 H i s 组氨酸 H R P ( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e )辣根过氧化物酶 I D A 亚氨二乙酸 k b ( K i l o b a s e )千碱基对 k D a ( k i l o d a l t o n )千道尔顿 N T A 氮川I 乙酸 O P D ( 0 P h e n y l e n e d i a m i n e )邻苯= 胺 P A G E ( p o l y a e

3、 r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 P B S ( p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ) 磷酸盐缓冲溶液 r p m ( r e v o l u t i o np e r m i n u t e ) 每分钟转数 Sr s e c o n d l 秒钟 “ I r i s ( T n s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e )三( 羟甲基) 氨基甲烷 中国坶洋大学 _ ￥论口

4、文昌鱼41 蛋白与血影蛋白、肌动蛋白结合活性中，b 的鉴定 摘要 红细胞特殊的细胞形态需要具有独特蛋白瞥架网的膜结构来维持。该蛋白骨 架网的主要组分包括：血影蛋白、肌动蛋白、4 】蛋白和锚蛋白等。其中4l 蛋 白和锚蛋白提供了膜骨架与跨膜蚩口之州的连接。脊椎动物4 】蛋白有四个高度 保守的类型：4I R 、4I N 、4l G 、4I B 。其中4 】R 蛋白是最早在红细胞中发现 的4 1 蛋白家族成员，被认为是4 l 蛋自家族的原型。脊椎动物中的四种4 】蛋 白含有相同的结构域：F E R M 、F A 、S A B 和C T D 结构域。在无脊椎动物中也发 现有类4 1 蛋白它通常由一个基

5、因编码，并且结构域组成中缺少S A B 结构域。 脊椎动物4 1 R 蛋白的S A B 结构域的功能是与血影蛋白和肌动蛋白结合那么无 脊椎动物中的4I 蛋白是否具有与血影蛋白和肌动蛋白结合的功能呢? 还有S A B 结构域是如何进化而来的呢? 这些问题尚不清楚。 文昌鱼属于头索动物，处于无脊椎动物和脊椎动物之问，是研究脊椎动物进 化和起源的模式动物。本实验室已经在文鱼( B r a n c h i o s t o m a 阚n 耙“m ) 中克隆 得到4I 蛋白基因( B j P 4 ”，发现它与其他无脊椎动物类4l 蛋白一样缺少S A B 结构域，但其体外表达重组蛋白，能够与血影蛋白和肌动蛋

6、白结合。我们通过 E L I S A 分析实验表明，人类4 l R 和文昌鱼B j P 4 1 蛋白与血影蛋白和肌动蛋白的 结合能力相近。为了研究对文昌鱼4l 蛋白与血影蛋白和肌动蛋白结合起关键作 用的位点，我们采用氨基酸切除法研究各表达蛋白和血影蛋白与肌动蛋白结合能 力。文昌鱼中的保守结构域包括F E R M 结构域、F A 结构域和C T D 结构域。散 布在这些保守结构域之间的区域，在F E R M 结构域N 一端的头部区域为u 1 ，在 F A 和C T D 结构域之间的为U 2 3 。首先切除u 1 和F E R M 结构域，构建了F U C 重组子，其重组蛋白具有结合能力，但与全长

7、比，结台能力下降了1 肥；在F U C 基础上构建F A 结构域重组子，其重组表达蛋白没有结合能力；在F U C 基础上 切除F A 结构域，得到U C 重组子，其重组蛋白结合能力与全长相比下降了l 2 左右：将U C 中的C T D 结构域切除，获得U 2 3 重组子，该重组蛋白的结台能力 与U C 相近；将U 2 3 结构域的前1 6 个氨基酸切除后，U 1 7 6 8 保持了与U 2 3 相 同的结合的能力。 U 2 3 结构域共台有6 8 个氢基酸在此基础J ，我们将U 2 3 结构域分成四 中闻海洋 学碗I F “论 部分，进行多肽台成，然后进行E L I S A 分析。实骑结果表删

8、，U I 6 和U 3 4 5 0 没有鲒合能力，U I7 3 3 有微弱的结合，U 5 1 6 8 仃稂强的结台但是与U 2 3 相比， 结合能力明显下降。进步采用定点突变，发j 见U 2 3 一 1 酸r I ：氨基酸D 3 8 7 的突变， 使其结合能力有所下降，但仍具有结台能力，该氩蜒酸位点D 3 s ，位于U 3 4 5 0 多 肚巾，为寻找更为关键的位点，还需进一步将u 5 1 6 8 多肽中的一些氩基酸进行 突变。 通过我们的实验发现，文昌鱼4I 蛋白的U 2 3 结构域仍然具有与血影蛋白 和肌动蛋白结合的能力，并且该结构域处1 。F A 和C T D 结构域之间，脊椎动物 S

9、A B 结构域也处于F A 结构域和C T D 结构域之间，加上文昌鱼特殊的进化地位， 我们推测文昌鱼41 蛋白U 2 3 结构域极有可能是脊椎动物4 】蛋白S A B 结构域 进化的原型。我们的实验结果j 丕表明文昌鱼U 2 3 结构域c 一端的l8 个氨基酸， 对4l 蛋白与血影蛋白和肌动蛋白的结合是极为关键的。 关键词：文昌鱼：膜骨架；41 蛋白：血影蛋白；肌动蛋白；S A B 结构域 十闭海洋太学口1t 毕n 论女 d e n t i f ic a t i or o ft h es p e c tr ina n dF - a c t in - b in d in g s i t e s

10、na m p h I o x u sPr o t e in4 A b s t r a c t f h eu n i q u em e m b r a n es t r u c t u r ei sn e e d e dt om a i t a i nt h em o r p h o l o g yo ft h e e r y l h r o c y t ea n dt h ep r o t e i ns k e l e l o nn e t w o r ki sn e e d e dt om a i n t a i nt h ee r y t h r o c y t e m e m b r a

11、 n es t r u c t r eT h i sm e m b r a n ec y t o s k e l eo ni s m a i n l yc o m p o s e do fs p e c t r i n ， a c t i n p r o t e i n4Ia n k y r i na n ds oO l l P r o l e i n4la n da n k y r i np r o v i d et w ol i n k st h a t f u n c t i o ni n d e p e n d e n t l yt ol e t h e rt h en e t w o

12、 r kt ot r a n s m e m b r a np r o t e i n sV e r t e b r a t e s h a v ef o u rh i g h l yc o n s e r v e dg e n e se n c o d i n gp r o t e i n4I ，t h e i rp r o t e i np r o d u c t sa r e k n o w na s4l R ( r e dc e i l t y p e ) ，41 N ( n e u r o nt y p e ) ，4I G ( g e n e r a lt y p e ) ，a n

13、d41 B f b r a i nt y p e ) P r o t e i n41 Ri sI h ef i r s tm e m b e ro f p r o t e i n41i d e n t i f i e df r o mr e db l o o d c e l l s ，a n di st h u sr e g a r d e da st h ep r o t o t y p i c a lm e m b e ro f p r o t e i n41f a m i l y A l lf o u r p r o t e i n si nv e r t e b r a t eh a

14、v eac o n l i n o no r g a n i z a t o no f d o m a i n s ，i n c l u d i n gt h r e eh i g h l y c o n s e r v e dd o m a i n s ：N t e r m i n a ld o m a i nF E R M ( f o u r p o i n t o n e p r o t e i n - e z r i n - r a d i x i n - m o e s i n ) ，s p e c t r i n a c t i n b i n d i n gd o m a i n

15、 ( S a B ) ，a n dC t e r m i n a l d o m a i n ( C T D ) A d j a c e n tt ot h eF E R Md o m a i ni s aF E R M a d j a c e n t ( F A ) d o m a i nA l l k n o w ni n v e r t e b r a t eg e n o m e sh a v eas i n g l ec o p yo fp r o t e i n4l g e n e sa n di tl a c k st h e S A Bd o m a i nT h eS A B

16、d o m a i no f t h e4l Ri nv e r t e b r a t ec o u l db i n dt os p e c t r i na n d a c t i nt op r o v i d et h ec y t o s k e l e t a ll i n k a g eW ew a n tt ok n o ww h e t h e rp r o t e i n4 】i n i n v e r t e b r a t ec o u l db i n dt os p e c t r i na n da c t i n a n dh o wt h eS A Bd o

17、 m a i no f p r o t e i n4 I i nv e r t e b r a t ee v o l v e d A m p h i o x u sb e l o n g st ot h ec e p h a l o c h o r d a t ea n d i sb e t w e e ni n v e r t e b r a t ea n d v e r t e b r a t eT h e r e f o r ei ti sam o d e la n i m a lf o rt h es t u d yo fe v o l u t i o na T l do r i g

18、i no f v e r t e b r a t eW eh a v ec l o n e dac D N A e n c e d i n g a na m p h i o x u sp r o t e i n4 1 ( B j P 4 I ) f r o m a m p h i o x u s ( B r a n c h i o s t o m aj a p o n i c u m ) ，a n de x p r e s s e d t h eB j P 4l r e c o m b i n a n t p r o t e i nE L I S Aa n a l y s i ss h o w

19、 e dt h a ti tc o u l db i n dt os p e c t r i na n da c t i nT h ea f f i n i t yo f r B j P 41 t o s p e c t f i na n da c f i n i sc l o s e dt ot h a to fh u m a n41 RT od e t e r m i n et h e 5 f n c m r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pa n de x p l o r et h ea c t i v es i t e so ft h

20、 e 肼P 41 v a r i o u s t r u n c a t e d 目P 4 】p e p l i d e s ( F U CU CU 2 3 ，a n dU 1 7 6 8 ) ，w i t ht h es p e c i f i cd o m a i n s 中国海洋丈芈唢 毕业论立 d e l e t e d w e r ee x p r e s s e di nEc o i la n ds u b j e c t e dt ob i n d i n ga n a l y s i sE l I S Aa s s a y s s h o w e dt h a tt h em

21、m c a t e dp e p t i d eF U Ch a sa na f l q n i t yt os p e c t r i na n da c g na n d d e c r e a s e db yt 3 c o m p a r a b l et ot h el u l l 吲P 4 l S i m i l a r l yt h et r u n c a t e dp e p t i d e sU C ， U 2 3 ，a n dU I7 6 8r e t a i n e ds t r o n ga f f i n i t i e s t o s p e c l r i n

22、a n da c l i n ，a i t h o u g ht h e i r b i n d i n ga c t i v i t i e sw e r er e d u c e db yI 2 H o w e v e Lt h et r u n c a t e dp e p t i d eF Ah a sf l o a f f i n i t yt os p e e t r i na n da c t i n A sU I7 6 8r e t a i n e dc o n s i d e r a b l ec a p a c i t yt ob i n dt os p e c t r i

23、 na n da c t i n ，t h e d i f f e r e n tp e p t i d e sd e r i v e df r o mU 2 3 ，leU 1 1 6 ，U 1 7 3 3 、U 3 4 5 0a n dU 5 1 6 8 ，w e r e s y n t h e s i z e db yS a n g o nB i o t e c hC oL i d ( S h a h g h a i ，C h i n a ) a n ds u b j e c t e d t ot h e b i n d i n ga s s a y T h ee x p e r i m

24、e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tU 1 6a n dU 3 4 5 0 a l ei n c a p a b l e o fb i n d i n gt os p e c t r i na n da c t i n ，U 1 7 3 3h a saw e a ka f f i n i t y , w h e r e a sU 5 1 6 8h a sa s t r o n gc a p a c i t yo f b i n d i n gt os p e c t r i na n da c f i nT h ep o i mm u t a t i

25、 o na p p r o a c hr e s u l t s s h o w e dt h mt h ea c i d i ca m i n oa c i d sD 3 8 7m u t a t i o ni nU 2 3m a k et h ea f f i n i t yd e c r e a s e I ns u m m a r y ，t h eU 2 3r e g i o ni na m p h i o x u sp r o t e i n41h a st h eb i n d i n ga c t i v i t yt o s p e c t r i na n da c t i

26、nW ep r e d i c tt h a tt h eU 2 3r e g i o ni sm o s tl i k e l yt h ep r o t o t y p eo f t h e S A Bd o m a i no f p r o t e i n41i nv e r t e b r a t eO u rr e s u l t sa l s os h o w e dt h a tt h eC t e r m i n a l l ga m i n oa c i d so f t h eu 2 gr e g i o nm a yh et h ek e yr e s i d u e s

27、t ol 引P 4lb i n d i n gt o s p e c t f i na n da c t i n K e yw o r d s ：A m p h i o x u s ；m e m b r a n es k e l e t o n ；p r o t e i n41 is p e c t r i n ；a c t i n ；S A B d o m a i n 十目# 大学mL 4 m 地i 目录 第一章文献综述1 1 红细胞膜 红细胞膜骨架 2 红细胞膛蛋白 l2 I 血影蛋白 1 22 肌动蛋白 23 锚蛋白 2 4 血红细胞4J 蛊臼 241 蛋白家族9 2 1 血红细胞4 1

28、 蛋白 2 l I 血红细胞4 i 蛋白的存在形式 2 】2 血红细胞4I 蛋自各结构域在红细胞膜骨架中的功能 2I3 血红细胞4I 蛋白的可变剪研与功能 2 】4 有核细胞中的41 R 型世其1 E 细胞定位信号 215 血红细胞41 R 蛋白结合m 影蛋白，肌动蛋白蛀小结构域 2 24 1 蛋白家族的其它成员 3 文昌鱼4 1 蛋白 3 4 1 6 I8 1 9 4 本文的研究目的和研究路线2 0 41 研究目的 2 0 42 技术路线 第二章文昌鱼41 蛋白与血影蛋白、肌动蛋白结台活性中心的鉴定2 2 1 前言2 2 2 材料和方法2 2 21 实验材料 2 2 2 l I 实验仪器 2

29、 12 质粒与菌株 2 l3P C R 扩增所需试剂 214 构建表达载体与菌株相关试剂与溶液 215 重组蛋白的诱导表达相关溶液 2 l6S D S 。P A G E 相关缓冲渍 2I7B C A 法测定蛋白质浓度相关试剂 2 18 包涵体复性相关溶液 219 重组蛋白结合分析所需试剂和溶涟 22 实验方洁 中国自， 大学碗毕论文 2 2I 文昌鱼B j r 41 氨基酸序列的牛物信息学分析 2 6 2 22 立昌鱼r B j P 4 1 和 娄4 I R ( E P B 4 1 ) 蚩向与I l t l 影蛋【E ： 和肌动蛋白之问的结台活性分 析 2 8 2 23 结构域切除法寻找文昌鱼

30、嘶NI 蛋n 结合括性中心 3 0 2 24 多肚台成法寻找文昌鱼两P 4i 蛋白的结合话性i p 心 4 4 2 25 点突变法寻找文昌鱼引P 4 i 强门的结合活性位点4 4 3 结果 3j 文昌鱼引P 4J 蛋白结构域分析 32 文昌鱼4 1 蛋白的系统进化分析 3 34 i 蛋白家族的基因结构分析 34 文昌鱼研P 4i 蛋白氨萋醇序列特征 3 4i 文昌鱼B j P 4l 蛋白氯基酸序列梭定位信替的预删 3 42 文昌鱼目P 4I 氨基酸序列中的富亮氢酸序列 3 43 文昌鱼酎P 41 氧基酸序耕生长的多序列比对 35 文昌鱼B j P 41 蛋白U 2 3 结构域二级结构比较分析

31、36 文昌鱼B j P 4I 蛋白与人类41 R 结台能力分析 37 文昌鱼BJ p 4I 切除结构域重组子的蛋白表选和纯化 37IF U C 、F A 、U C 、U 2 3 和U l7 6 8 结构域片段的获得 4 7 372p E T - 2 8 - F U C 、p E T - 2 8 一刷、p E 2 8 一U Cp E T - 2 8U 2 1 3 - p E T - 2 $ 一U I7 6 8 表达载体的构建 373 重组蛋白在大肠杆菌巾的表达和纯化 38 重组于p E T - 2 8 - F U C 、p E T - 2 8 - , C A 、p E T - 2 8 - U C

32、 、p E T - 2 8 - U 2 3 、p E T - 2 8 一U 1 7 6 8 表达蛋白的 结合分析 39 多肚的结台分析 31 0 点突变对文昌鱼引P 4 4 讨论 蛋白结合能力的影响 参考文献 致谢 作者简介 硕士研究生期间发表的学术论文 盯 如 弛 N 盯 舱 立g 鱼4I 证 。m # 撮自、m 噩C j 台括性中。的牲定 第一章文献综述 1 红细胞膜 在动物的发展演化过程中，细胞逐步分化成组织，整个动物的生理机能由各 组磐I 功能组合完成在这个过程中，膜结构域的分化和信号复合物的形成是必不 r 日少的。随着哺乳动物的进化，细胞不断分化，出现了一个细胞类型分化的极端， 就是

33、哺乳动物无核血红细胞的出现( B a i n e sA J ，2 0 1 0 ) 。哺乳动物红细胞没有细胞 核和其它细胞器，因此没有主要的生物合成修复机制。尽管如此，它们却能够在 循环系统中忍受循环的严格条件存活1 2 0 天，这表明红细胞膜有一些结构功能上 的适应，对红细胞膜的脂双层起到支撑作用。 维持红细胞两面凹的圆盘状结构，需要依靠特有的膜结构支撑，因此红细胞 膜具有复杂的细胞骨架结构，该结构的组成需要多种成分的参与，红细胞膜上的 蛋白依据S D S P A G E 凝胶上的分离条带的位置进行命名，通常包括：血影蛋白 ( s p e c t f n ) 、锚蛋1 3 ( a n k y

34、r i n ) 、带3 ( b a n d3 ) 蛋白、4 】蛋白、42 蛋白、肌动蛋1 3 ( a c t i n ) 、 血型糖蛋E d ( g l y c o p h o r i n ) 等。血影蛋自在发挥功能，参与构建细胞骨架时，通常 形成血影蛋1 3 - - 聚体，是由q 血影蛋白和B 血影蛋白组成的异二聚体，分子量 大小分别为2 4 0k D a 和2 2 0k D a ；锚蛋白分子量大小为2 0 6k D a ；带3 蛋白分子量 大小为9 5k D a ；4 1 蛋白分子量大小为8 0k D a ；42 蛋白分子量为7 6 k D a ：4 9 蛋白 分子量为4 8k D a ；

35、肌动蛋白分子量为4 2k D a ( 卢义钦等，2 0 0 5 ) 。这些蛋白通常被 分为分为两种：外周蛋白包括血影蛋白、肌动蛋白、41 蛋白、42 蛋白、锚蛋白 等；整合蛋白包括带3 蛋白和血型唐蛋白。 1 1 红细胞膜骨架 红细胞膜骨架主要的组成是以血影蛋白一肌动蛋白为基础形成细胞骨架蛋白 网，连接于红细胞质膜的内表面( M a r k oe ta l ，2 0 0 7 ) 。其基本结构是由血影蛋白四 聚体与肌动蛋白纤维丝交联形成以六角形为主的晶格，在晶格角顶点形成交叉复 合物( j u n c t i o nc o m p l e x ) ，交叉复合物通过血影蛋白而相互连接，并且可以结合

36、 多个肌动蛋白。在磷脂取层和血影蛋白一肌动蛋白骨架之间有两个主要的蛋白桥 进行连接：在维持膜的完整性方面比较重要的锚蛋白一血影蛋白桥，使得血影蛋 白通过锚蛋白连接于跨膜蛋白带3 蛋白；第二种是血影蛋白通过4I 蛋白连接于 Z 目鱼4I 粥f J t l m 嚣伍口、m 动堑自站台话性中。的崔定 遍布膜L 的血型糖蛋白c ( W i l f ia I T l ，2 0 0 9 ) 。即血影蛋白一肌动蛋白骨架通过4I 蛋 白和锚蛋自分9 0 连接于膜整台蛋白胁型稿蛋向和带3 蛋白L ，再加卜内收蛋白、 原肌球蛋白、原肌球调节蛋白和成束素( d e m a O n ) 等的参与，使得该骨架品格牢固

37、地覆盖在膜脂双层上( 图1 1 ) f O i l l i g a ne Ia l ，1 9 9 3 ) 。 图1 1 人类红细胞膜结构组织。 F i g1 - 1T h es t r u c t u r a lo f t h eh u m a ne r y t h r o c y l e m e m b r a n e ( F r a n c o T ，2 0 1 0 ) 12 红细胞膜蛋白 生物体为适应红细胞的细胞结构，形成了特定的细胞膜骨架，其中血影蛋白、 肌动蛋白、41 蛋白、锚蛋白和内收蛋白( a d d u c i n ) 等蛋白的相互作用对膜骨架是 比较重要的。这些蛋白组成的复合

38、物形成了一个支持动物生命的重要系统：在动 物的进化过程中，为适应不同时期的生活，它们已经具备了多种不同的功能。血 影蛋自一锚蛋白41 一内收蛋白复台物，在膜的转运、特定信号与细胞粘着复合物 的装配、提供脆性细胞膜机械稳定性等方面，参与部分结构的彤成。在很多遗传 性疾病中，例如失聪、心律失常、脊髓小脑运动失调和遗传溶血性贫血( 球形红 细胞症、椭圆彤红细胞贫血症、热异形细胞增多症) ，都发现了这一复合物的缺 陷。该复合物中有的蛋白还作为肿瘤抑制予而起作用，这些都表明在哺乳动物红 细胞的正常生命过程中离不开这些蛋与( E b e re ta l ，2 0 0 4 ；G a l l a g b e

39、r 甜a l ，2 0 0 4 ) 。 血影蛋白、锚蛋白、4 1 蛋白和内收蛋白是与后生动物一起进化的( B a i n e s ，2 0 1 0 a ) ， 肌动蛋白在原核细胞中就已经出现( 贺淹才，2 0 0 2 ) ，锚蛋白、内收蛋白和41 女目鱼4 1 豳自m 自、m 动萤0 # 0 * 性中b 的鉴定 蛋白罡在组织的进化过程中出现的。影蛋白与锚蛋白之间的相互作用是生物体 形成组织的先决条件，而4I 蛋白是随着脊推动物的出现，才获得了结台血影蛋 白和I 动蛋白f 1 0 1 f l ) J ( B a i n e s2 0 1 0 b ) 。其中血影蛋白、4l 蛋白、锚蛋白和内收蛋 白

40、这四种蛋白最先在红细胞中发现维持若红细胞膜的形状和弹性：在红蜘胞笈 生过程中它们还控制着一些跨膜蛋白在红细胞质膜上的积累( M o h a n d a se la 1 2 0 0 8 ；S a l o m a o e ta l ，2 0 1 0 1 。 l2 1 血影蛋白 在低渗和弱碱性溶液中，红细胞释放出来的蛋白中有一对高分子量的多从， 被命名为血影蛋自l ( M a r c h e s ia n dS t e e r s ，1 9 6 8 ；T i l l a c ke ta l ，1 9 7 0 ) ，这两条蛋白分 别被称为* 血影蛋白和B 一血影蛋白，分子量分别为2 8 0 k D a

41、 和2 4 6 k D a ，它们在 S D S P A G E 凝胶中是两条最高分子量的蛋白，因此有的将其命名为带1 蛋白和带 2 蛋白( F a i r b a n k se ta l ，1 9 7 1 1 ) 。血影蛋白是红细胞膜蛋白的外周蛋白( G a l l a g h e r P Ga n dF o r g e tB G , 1 9 9 3 ) ，是肌动蛋白的结合蛋白和交联蛋白，在后生动物进化 的直接祖先进化过程中就已经出现( B e n n e t te ta l ，2 0 0 1 ) 。 在血影蛋白进化的早期，血影蛋白就被分化为C t - 血影蛋白、B 血影蛋白和B 一 重链(

42、 p H ) 血影蛋I 二l ( B a i n e s A J ，2 0 0 9 ) 。无脊椎动物中有一个叶血影蛋白基因， 一个传统的p 血影蛋白基因和一个p V - 血影蛋白基因。哺乳动物中有七个血影 蛋白基因：两个q - 基因( S P T A l 和S P T A N l 分别编码1 血影蛋白和n I I 一血影 蛋白) 、四个传统的B 一基因( S P T B 、S P T B N l 、S P T B N 2 和S P T B N 4 分别编码 B I - p ) 和S P T N 5 编码一个p 一重链( B H ) 血影蛋白。在无脊椎动物的进化中，有 两轮的整体基因组复制( 2

43、 R 假设) ，每一个祖先基因，在脊椎动物中都会有四个 同源基因( K a s a h a r a ，2 0 0 7 ) 。对于硬骨鱼来说，有可能会有8 个基因拷贝，因为 在硬骨鱼中又有一轮新的基因复制( V a nd eP e e rY ，2 0 0 4 ) 。这一规律在传统的D 一 基因中得到了验证，但在d 一基因和B V 基因中没有，这可能表明在脊椎动物中 保持血影蛋白基因全部的复制是对它们的生存是不利的。哺乳动物中有aI 和 q 1 1 一血影蛋白，推测在哺乳动物的进化中，发生了一次d 一血影蛋白基因的复制， 因此* 基吲的复镱4 可能在哺乳动物基困组中是晚期的进化事件，在哺乳动物无核

44、 红细胞出现的同时，C tI - 血影蛋白由已经存在的n 血影蛋白基因复制得到。哺乳 动物的阴可能是无脊椎动物p V 进化而来。在两栖娄、鸟类和爬行动物的基因 文B 鱼4 I 蛋自。o m 髟虽自、肌劬噩自结台活性中。的鉴定 组中只含有一个n 堪。在硬旨鱼的进化t p ，也并不是所有基I 划的复制都保存下 柬，例如在斑马鱼中5 - 基因的个拷脚就足石表达的假基闪( S a l o m a oe ta l ， 2 0 0 6 ) a 小血影蛋白、0 血影蛋白和p H m 影蛋白是通过结构域进行定义区分。a 血 影蛋白古有2 0 个完整的由1 0 6 个氨基酸组成的连续重复单位组成( S p e

45、i c h e ra n d M a r c h e s i ，1 9 8 4 ) ，传统的B 血影蛋白古确1 6 个完整重复阴一血影蛋白含有2 9 个完整重复。这些重复单位以j 蝶旋柬进行折叠被称为血影蛋白重复( Y a he ta l ， 1 9 9 3 ；P a s c u a le ta 1 1 9 9 6 ) 。最近有报道表明n 一血影蛋白的第9 和第1 0 个重复之 间的S H 3 结构域( M u s a c c h i oe t 甜，1 9 9 2 ) 与C 一端是钙调蛋白样结构域 ( c a l m o d u l i n 1 i k ed o m a i n ) 能够结合于

46、42 蛋( K o r s g r e ne ta l ，2 0 0 9 ) 。C - 端钙调 蛋白样结构域中古有四个E F 臂，其中两个盱臂能够与钙结合( T r a v eda l ，1 9 9 5 ) 。 B 一血影蛋白N 一端的一对钙调蛋白同源结构域( c H ) 形成一个肌动蛋白结合结构 域( A B D ) ( K a r i n c he la l ，1 9 9 0 ；C a r u g oe ta l ，1 9 9 7 ；B a n u e l o se ta l ，1 9 9 8 ) ，也能够 结合4 】蛋白，这样形成4l 蛋白、血影蛋白和肌动蛋白三聚物，该复合物有效 地加强

47、了血影蛋白和肌动蛋白之间的相互作用( 图卜2 ) 。A B D 结构域也能够与脂 质P I P 2 结合，该结合能够促进4 1 蛋白的结合( A ne la l ，2 0 0 5 ) 。 S p e c t t i nd i m e t E V LT E S I C a M ) “ ：i 帮8 l 。”瑚 目1 2 血影蛋白= 聚体及单体结构域组成。 F i g I - 2 T h es t D i c D l r eo f t h es p e c 研nd i m e ra n d t h e d o m a i n o f t , h e m o f l o m er _ 在生理条件下，血

48、影蛋白的主要存在形式是四聚体( U n g e w i c k e l la n d G r a t z e r , 1 9 7 8 ) 。在3 7 “ C 下分离红细胞膜的提取物，d - 血影蛋白和B 血影蛋白形成二聚体 ( G r a t z e r a n d B e a v e n ，】9 7 5 ；R a l s t o n ，1 9 7 5 ) 。如果提取物在4 C 下，血影蛋白会恢 复成由两个二聚体组成的四聚体。而在3 7 ( 2 分离脑部血影蛋白，最初是四聚体 形式( B e n n e t te ta 1 】9 8 2 ) 。不同位置的血影蛋白的最基本的组成都是四聚体形 j 日自4l 口1 7 I n # 自、肌自自镕e 镕B 十n 的 式，z 所以有这种现象的发，F ，是因为在不同位置，组成四聚体结构( 红细胞中 的- 0 I ：脑部的n I I 1 3 】) 的单体结合位点亲和力不同。脑部的n 1 1 1 3 1 1 相互 作I | 的亲和力远远大于红细胞中a1 + 8 】之间的亲和力( K o l u l ae t a l ，1 9 9 3 ； B i g n o n ea n dB a i n e s2 0 0 3 ) 。红细胞膜七也可以形成更有规则的低聚物在整个红 细胞膜上结合有