复方扶芳藤合剂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响及其机理的探讨.pdf

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1、 3 方扶芳藤合剂含药血清促进 BMSCs 增值过程中，复方扶芳藤合剂含药 血清可以使 Notch1、Jagged1、hes1 的 mRNA 和蛋白表达上调；(3)复方 扶芳藤合剂通过激活 Notch 信号通路对 BMSCs 促进增殖， 复方扶芳藤合 剂对 Notch 信号通路的影响可能是抗衰老机制之一。 关键词：复方扶芳藤合剂；大鼠骨髓间充质干细胞；增殖；NOTCH 信 号通路 4 Effect of Compound Fufangteng Mixture of rat bone marrow mesenchymal stem cells on proliferation and the p

2、ossible mechanism ABSTRACT Objective: To establish a culture system of rat bone mesenchymal stem cells by Cell Culture Technique in vitro. According to observing the regulation of Compond Fufangteng Mixture durg-containing serum on Notch signa pathway during MSCs proliferation, to clarify the mechan

3、ism of MSCs proliferation promoted by Compond Fufangteng Mixture , and to explore a new way of anti-aging for Chinese medicine and fomulas. Methods: (1) Used Cell Culture Technique in vitro to establish rat bone mesenchymal stem cells culture system and observed the cell morphological characteristic

4、s at different stages;(2) Cell growth curves were drawn by MTT method; The cell cycle and expression of BMSCs surface antigens were detected by flow cytometer; BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts. Through the above method to identify BMSCs;(3) A total of 30 rats were randomly divide

5、d into 2 groups, 15 per group, and Compound Fufangteng Mixture was given by gavage for the rats as drug intervention group,while physiological saline was given as negative control group. Use the 10% medicated serum and negative control to intervene BMSCs. Then used MTT method to test the effect of C

6、ompound Fufangteng Mixture on BMSCs proliferation;(4) Used RT-PCR to detect the mRNA expression of Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA before and after intervention;(5) Used immunofluorescence cytochemical method to detect the the protein expression of Notch1 and Jagged1 before and after intervention. 5 Result

7、s: (1) Under the inverted microscope, the adherent BMSCs were spindle cell-based, showing radial colony arrangement;(2) The growth curve was S-shapedand the cell growth cycle was 7-day. Flow cytometric detection of BMSCs cell cycle testing testing results showed that G0/G1 phase cells accounted for

8、about 82.7%. And BMSCs were positive for CD44、CD90, and the positive rates were 99.4%、 99.7% respectively. But negative for CD45, the positive rates were 0.21%. For induction,Alkaline phosphatase staining and alizarin red staining produced a strong reaction in cells. Above method demonstrated that t

9、hey were consistent with the growth characteristics of normal BMSCs and had vigorous growth;(3) Comparing with saline negative control group，MTT results showed that Compound Fufangteng Mixture drug-containing serum can promote the proliferation of BMSCs(P7g/ml)，前后比较 P0.01，认为复方扶芳藤合剂对提高机体血锌浓度有一定作用。陈黎临

10、 床观察发现同时和化疗同步连续给予该药，对大肠癌术后化疗引起的白 细胞减少也有很好的疗效46。朱红梅等47发现复方扶芳藤合剂中的扶芳 藤水提液、醇提液均能使小鼠胸腺和脾脏重量明显增加，提示扶芳藤水 提液、醇提液有提高机体非特异性免疫功能。 ，这些都提示复方扶芳藤合 剂可以通过提高非特异性免疫从而达到防病抗衰的功效。陆英莲等48发 现， 复方扶芳藤合剂可使健康小鼠红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力显 49 著增加；对地塞米松致炎阳虚模型小鼠红细胞中 SOD 活力降低有十分显 著的拮抗作用。揭示复方扶芳藤合剂有扶正祛邪、延缓衰老的功效。谢 干琼等49采用美国黑腹野生型果蝇对复方扶芳藤合剂进行“寿

11、命实验” ， 发现该合剂能使雌、雄性果蝇平均寿命分别延长 7.7%和 8.4%，对两性果 蝇最高寿命有显著影响，食用含复方扶芳藤合剂饲料的果蝇，显得健壮， 活动能力强，飞翔能力高于对照组。雷肖环等50为探讨复方扶芳藤合剂 延年益寿作用，选择健康雄性小白鼠，随机分为复方扶芳藤合剂组和对 照组，分别用复方扶芳藤合剂 15ml/ kg 以及等量生理盐水灌胃，给药前 后测定血红蛋白含量，15d 后，复方扶芳藤合剂组血红蛋白明显升高，与 对照组比较有显著性差异(P0.05)。另有报道，复方扶芳藤合剂能延长果 蝇，小鼠的平均寿命；可降低果蝇头部和小鼠肝脏脂褐素含量；抑制小 鼠肝脏内 MAO-B 活性，对单

12、胺氧化酶的抑制率为 60.5% (P0.05)51。李 慧等52从性功能和内分泌的角度探讨复方扶芳藤合剂抗老延年、强身健 体的作用机理，发现其能升高小鼠精子活动百分率(P0.01)，增加雄鼠交 配次数(P0.01)及同笼雌鼠受孕率(P0.05)和胎鼠数(P0.01)； 能增加雌性 大鼠卵巢 HCG 受体数目， 能使老年大鼠附性器官重量增加并明显提高血 清性激素水平，但对去势年轻大鼠影响不大。 50 结 论 （1） 本实验通过全骨髓贴壁法体外分离培养 BMSCs， 通过对 BMSCs 的扩增、培养和传代，总结了 BMSCs 不同时期的细胞形态以及不同阶 段细胞生长特征。 （2）通过 MTT 法绘

13、制细胞生长曲线及流式细胞仪检测细胞周期、 细胞表面标志及向成骨诱导分化能力的检测，鉴定所获得的细胞是较为 纯化的 BMSCs。 （3）复方扶芳藤合剂含药血清可促进 BMSCs 的增殖。 （4） 在 BMSCs 增值过程中，复方扶芳藤合剂含药血清可以 Notch1、 Jagged1、Hes1 的 mRNA 表达上调，复方扶芳藤合剂含药血清可以使 Notch1、Jagged1 的蛋白表达上调，从而激活 Notch 信号通路。复方扶芳 藤合剂对 BMSCs 的促增殖作用可能是抗衰老机制之一。 51 存在的问题和展望 干细胞在动物体内的数量非常稀少，且数量恒定，不会主动增殖。 它们一般都处在休眠状态，

14、只有在细胞外信号刺激的情况下，才会进入 增殖或者分化环节，参与机体的调节。但是对于干细胞增殖和分化的分 子调节机制，目前国内外仍然所知甚少。就目前的研究现状推测，干细 胞增殖和分化的调节是一个极其复杂的网络机制，存在着多条信号通路 的联合作用。 1 存 在 的 问 题 因时间问题，本实验仅复方扶芳藤合剂整方进行了研究，未对其组 成药物之间的关系，药效物质基础进行分析，如能更全面的进行分析和 研究，那么研究的深度则更理想。 本实验应用的是复方扶芳藤合剂含药血清，对体外培养的细胞进行 研究，结果与药物在体内代谢有一定差异，下一步实验应在动物体内进 行实验，这样实验结果才更具说服力。 2 展 望 复

15、方中药在抗衰老方面的作用是有目共睹的，利用复方中药具有多 途径多靶点的作用特点，结合现代最为先进的实验技术、方法，进一步 探索中药单体、有效成分或含药血清促 MSCs 增殖的多种可能机制，在 今后的研究中应尽可能提高中药有效成分的纯度，利用干细胞在抗衰老 方面具有的巨大优势，研究了复方中药促进干细胞增殖的分子机制，将 不断发现的生命科学新观点，与中医基础理论相互结合，从而达到延缓 衰老、提高老年人生存质量的目的。 52 参 考 文 献 1 王新玲, 李月彩, 侯颖春, 等. 自由基、 细胞凋亡与衰老关系的研究进 展J. 中国老年学杂志, 1999, 19(4): 252. 2 Hong She

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23、is 多能干细胞(multipotential stem cell)，具有分化出多种组织和 器官的潜能; 专能干细胞( unipotent stem cell)，只能分化成特定的组织或 细胞。根据其发展阶段和来源不同，干细胞又可分为胚胎干细胞 (Embryonic stem cells，ESC) 和成体干细胞(Adult stem cells，ASC)2。 信号通路是细胞生命周期中的“神经系统”，今年来的研究表明干 细胞的增殖、分化受自身或外在多种信号通路的调控，引起细胞与细胞 之间相互通讯。Notch信号通路广泛存在于各种动物细胞中， 在调节细 胞分化、增殖和凋亡中发挥重要作用3 ，它的配体

24、和受体都是细胞膜表 面蛋白，因此是介导细胞间通讯的一种重要方式。许多研究显示，在干 细胞多条增殖、分化途径中都都有Notch信号通路的存在。 1 Notch 信号通路 Morgan 在果蝇体内发现一种基因，因其功能部分缺失可导致果蝇翅 缘出现缺口，故命名该基因为 Notch4。Notch 信号传导通路广泛存在于 脊椎和非脊椎动物中，在进化上具有高度的保守性。它的受体通过与配 体的相互作用转导细胞信号，从而在细胞增殖发挥重要的调控作用5。 Notch 受体和配体都是跨膜蛋白， 因此信号通讯被限于两相邻细胞 58 间进行。哺乳动物已知有 4 种 Notch 受体 Notch1，Notch 2，No

25、tch 3， Notch 4和5种配体Delta1、Delta3、Delta4 、Jagged1、Jagged2，但是有 关 Delta-like3 与受体结合发挥功能的证据知之甚少6。 Notch 相对于其他信号通路结构较简单，没有第二信使的参与，由 两个邻近细胞的 Notch 受体与配体相互作用而激活7。现有研究提出了 Notch 信号活化的“三步蛋白水解模型”8。首先，Notch 以单链前体模 式在内质网合成，后转运至细胞膜，形成成熟的 Notch 受体。当 Notch 受体与配体结合，Notch 受体又相继发生 2 次蛋白水解。第一次在由肿 瘤坏死因子 -转化酶(TNF- conver

26、ting enzyme，TACE)的作用下，释放 出与 Notch 配体连接的胞外部分；第二次是在早老蛋白(presenilin，PS) 的介导下发生蛋白水解作用，使其胞内部分 (Notch intracellular domain，NICD)释放入胞浆，并进一步转移到细胞核，同 DNA 结合蛋 白 CSL、C SL 的辅激活物 Mam 一起开启下游基因的转录，发挥生物学 功能9。 Notch 下游的靶基因中，最具代表性的是 Hes 基因家族。NOTCH 信 号通路的持续活化可上调Hes1基因的转录，从而抑制特异靶基因的转录 10。 2 Notch 通路与造血干细胞的增殖 在造血干细胞的培养中

27、，通过激活 Notch 通路来维持干细胞的自 我更新已经取得了一定的进展。Varnum Finney等11转导了Lin-、ckit+、 scal+细胞 （LSK） ，这些细胞包含了HSC的大部分表型，可以活化Notch1 胞内区（NICD）。与未转导的细胞相比，转导细胞不再只生长到 25 天 就停止生长，其能继续维持未分化状态且能增生 8 月以上，这表明激活 Notch 信号能增加 HSC 自我更新能力。用 LSK 所做的体内移植试验表明 11，所有的血细胞均能再生，尽管 B 细胞重组减少，但在细胞家族定位 上 Notch 的作用是一致的。Stier12等以活化的 Notch1 转导 Lin、

28、scal+ 细胞，结果发现，活化的 Notch 信号能抑制体内和体外 HSC 分化，促进 59 其 增 殖 。 Han 等 构 建 了 来 自 于 人 hDll1 的 可 溶 性 重 组 蛋 白 hDll1NDSL(由 DSL 结构域及 N 端序列构成)，经小鼠细胞体外实验证 实，在联合其他细胞因子的情况下，可以抑制造血干细胞的分化并促进 其增殖13。Ye 等通过逆转录病毒增强活化型的 Notch 4 的表达，证实 其可以抑制造血干 / 祖细胞的分化并促进其增殖14。Duncan 等在自 然杂志上发表文章，检测了 Notch 信号被阻断的造血干细胞重建造血 系统的能力，提示 Notch 信号的

29、阻断导致了更高的分化率，从而阻断了 造血干细胞未分化状态的维持。所以认为活化的 Notch 信号能抑制造血 干细胞分化，维持其多潜能性，并可进一步促进其增殖15。 3 Notch 通路与骨髓间充质干细胞增殖 牛萍等在研究 Notch 信号通路对骨髓间充质干细胞的增殖调控作用 中，利用免疫印切迹检测发现骨髓间充质干细胞存在 Notch1-Jagged1 通 路，说明 Notch 信号通路对体外培养的骨髓间充质干细胞有调控作用 16。为了明确具体的调控作用，将骨髓间充质干细胞在体外培养后，进 行诱导分化，研究分化后 Notch 信号通路表达情况。结果显示骨髓间充 质干细胞在体外增殖能力强，可传多代

30、，并可诱导成成骨细胞核软骨细 胞。徐洪雨等在研究骨髓干细胞向肝细胞分化中过程中发现，当干细胞 处于增殖状态时，干细胞均强烈表达 Notch 1 蛋白；而在向肝细胞分化 中，Notch1蛋白表达出现降低，Notch1 mRNA也表现降低，而随着分化 率的增高，Notch1 蛋白及 Notch1 mRNA 持续降低17。邢莹等采用免疫 荧光和RT-PCR技术检测Notch信号系统相关分子的表达情况，结果显示 hMSCs 高表达受体 Notch1 蛋白、配体 Jagged1 蛋白、调节蛋白 PS1 和靶 基因 Hes1 的 mRNA，提示 hMSC 的 Notch信号系统处于激活状态，而这 种状态可

31、能有利于维持 hMSC 的高增殖状态18。 研究发现 Notch 信号系统对骨骺干细胞的增殖也有调控作用，Notch 信号被抑制时，骨骺形成明显增多，说明 Notch 信号系统对其分化为骨 骺有明显的抑制作用19。 60 4 Notch 通路在胚胎干细胞分化过程中的作用 Nemir 等 20在体外观察了胚胎干细胞分化过程中 Notch 信号通路的 表达情况，证实 Notch 信号通路是调控胚胎干细胞向心肌细胞分化的关 键因子，在分化过程中，Notch 受体、配体的表达是下调的，通过上调 Notch 信号可抑制胚胎干细胞向心肌细胞分化。Xiao 等21通过对小鼠胚 胎干细胞诱导分化为神经细胞过程

32、中 Notch 蛋白的变化发现，小鼠胚胎 干细胞中 Notch1 蛋白表达较强，而随着 RA 的诱导分化，神经细胞逐渐 增多，与此同时 Notch1 蛋白也随之减少。这说明 Notch1 蛋白的减少与 分化诱导时间密切相关，与神经细胞分化趋势呈负相关。然而最近有文 献表明22，持续表达的 HES1 通过抑制 DLL1 及 Jagged1 配体抑制 Notch 通路，从而抑制胚胎干细胞向神经细胞分化。因此，Notch 通路与 HES1 之间的反馈调节在胚胎干细胞调节分化方面的作用仍需进一步的实验证 实。 5 Notch 通路在造血干细胞分化过程中的作用 在造血干细胞的生存和分化中细胞因子起着重要

33、的调节作用，但 细胞分化方向则受到细胞间相互作用的调控，而 Notch 信号转导通路作 为细胞间相互作用机制之一，在造血干细胞自我更新调控中起至关重要 的作用23。Notch 受体和配体在造血干细胞发育不同阶段表达种类和表 达量均不同，如在未分化的造血干细胞表面，Notch 1 和 Notch 2 很少被 检测到，而在已经向髓系和单核系分化的细胞中有 Notch 1 和 Notch2 的 高表达。骨髓基质细胞中可以检测到Jagged 1， Delta 1和Delta 4，胸腺 上皮细胞表面则主要表达 Jagged 1， Jagged 2 和 Delta 124，表明 Notch 信号通路在细胞

34、发育的不同阶段作用机制可能不同。体外研究证实， Notch 配体 Delta 1 能够提高淋巴系和髓系细胞的自我更新能力并使细胞 向淋巴系分化，然后进一步分化为 T/NK 细胞。Delta 1 还能够抑制单核 细胞转变为巨噬细胞，使其向树突状细胞转化。不同的细胞因子也能够 调节 Notch 信号的作用，如 IL-7 能够促进 T/NK 细胞的分化，G-CSF 和 61 GM-CSF 能够促进髓系的分化25。 6 Notch 通路在骨髓间充质干细胞分化过程中的作用 骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cell，MSC) 是一种位于骨髓 中具有自我更新、分化增殖和多向分化潜能的干

35、细胞，在特定的微环境 和适宜的细胞因子作用下可分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪及神经 元等多种组织细胞，在骨髓间充质干细胞分化的过程中，Notch 信号通 路起着关键的作用。 6.1 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 向 平 滑 肌 细 胞 分 化 Kurpinski等26采用了JAG-1包埋、过表达及NICD及OP9-DL1细胞 共培养三种方法增强 Notch 信号，发现 MSC 中平滑肌标志物如 MYH11、-SMA、MYOCD 等均有所增强。说明 Notch 通路的激活可促 进 MSC 向平滑肌细胞分化。Tang 等27也发现了同样的结果。进一步研 究表明，内皮细胞 JAG-1 表达是血管

36、平滑肌细胞发育过程中必需的，故 JAG-1-Notch 通路可能是平滑肌细胞分化的重要信号通路，但具体机制 尚不明确。最新文献报道28，通过增强胞内 TGF- 信号，采用基因微阵 列(DNA microarray)的方法，检测到平滑肌标志物基因及JAG-1基因表达 增强。同时利用 siRNA阻断 JAG-1 基因后，发现 TGF- 诱导的平滑肌标 志物基因增强明显减弱。从而说明 TGF- 通过 JAG-1-Notch 通路调节 MSC 向平滑肌细胞分化。这可能是 Notch 通路调节平滑肌细胞分化的机 制之一。 6.2 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 向 成 骨 细 胞 分 化 Wang等29

37、研究了Notch信号在BMMSC向成骨细胞分化的作用，他 们采用 PT-PCR 方法在 hMSC 中检测到了 Notch-1、Jagged-1 的表达，说 明 Notch信号可能具有调节 MSC 分化的生理作用。此外，他们还通过逆 转录病毒将 Notch-1 的胞内区 DNA 序列转染进入 hMSC 中使 NICD 过表 达，通过一系列验证成骨细胞的实验，包括细胞内碱性磷酸酶染色、钙 化结节染色等表明，Notch 信号刺激骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分 62 化。 6.3 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 向 软 骨 细 胞 分 化 Oldershaw 等30通过实时定量 PCR 检测发现， J

38、agged1 在软骨形成 早期表达量增高，之后降低，为了解由Jagged1介导的Notch信号通路在 软骨形成中的作用，研究人员构建了包含表达 Jagged-1 基因的腺病毒载 体，将其转染到 hMSC，使 Jagged1 蛋白过表达。结果发现，Notch 下游 靶基因 Hey-1 表达得到了明显激活，这说明Jagged1 启动了Notch信号通 路。将转染 Jagged1 的 hMSC 在三维细胞聚团培养中诱导成软骨时，发 现软骨的形成受到了抑制，而对照组的 hMSC 诱导形成的软骨发育正 常。研究表明，在 HMSC 中由 Jagged1 介导 Notch 信号通路为启动成软 骨所必需，但是

39、它必须被关闭才能使软骨的生成得以继续。 6.4 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 向 肝 细 胞 分 化 徐氏17等采用 HGF、FGF-4 直接诱导和间接共培养两种方法研究 Notch通路在MSC分化为肝细胞过程中的变化。研究发现，MSC均强烈 表达 Notch-1 蛋白，但随着向肝细胞的分化，Notch-1 蛋白的表达逐渐降 低，Notch-1mRNA 也表现降低，与对照组相比有显著差异。同时，在共 培养培养液中加入通路阻断剂后，细胞分化率明显增加。这些都表明， Notch 通路的激活可以抑制 MSC 向肝细胞分化。但是，Notch 信号通路 通过调节哪些转录因子或者基因来控制向肝细胞分化，

40、目前尚不清楚。 4 展 望 Notch 信号通路是一条保守而重要的信号转导通路，对干细胞的增 殖和分化具有决定性的调控作用。除 Notch 外，还存在其他的通路如 Wnt、NF-KB 等，也参与干细胞的自我更新与分化过程。它们不是独立 的，而是通过相互协调作用共同调节干细胞的增殖和分化。因此，进一 步研究清楚 Notch 通路与其它信号通路之间的协调作用，更能确定干细 胞的分化因素，从而为进一步的组织如抑制肿瘤细胞分化、干细胞修复 等提供了可靠的依据。由于干细胞具有自我更新和多项分化潜能的特 63 性，若通过信号通路将干细胞定向诱导增殖或分化成需要的组织，在临 床应用上可避免排斥反应，用于细胞

41、替代疗法、组织器官移植和基因治 疗。也可靶向治疗诸如心血管、神经系统等复杂病症，为干细胞治疗开 拓了一片新天地。 参考文献 1 雷萍, 沈关心. 干细胞概述. 实用医学进修杂志, 2004. 32: p. 1-5. 2 林戈, 卢光琇. 干细胞概述. 生命科学, 2006, 18: p. 313-317. 3 Hard ingham TE, Oldershaw RA, Tew SR. C artilage, SOX 9 and Notch signa is in chond rogenesis. J Anat, 2006;209(4): 469-480. 4 Kojika S, Griffin

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