《松江鲈(Trachidermus fasciatus)组织蛋白酶B和L的基因克隆、蛋白表达与表达模式分析.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《松江鲈(Trachidermus fasciatus)组织蛋白酶B和L的基因克隆、蛋白表达与表达模式分析.pdf（86页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、 口 口 力量只互硕士学位论文 目录 中文摘要1 A B S T R A C T ：； 缩略词5 第一章文献综述6 1 1 松江鲈的研究情况介绍6 1 1 1 松江鲈的生物学概况6 1 1 2 松江鲈的历史分布与保护现状6 1 1 3 松江鲈的科学研究情况介绍6 1 2 组织蛋白酶的研究情况介绍7 1 2 1 组织蛋白酶名称的由来7 1 2 2 组织蛋白酶的分类与分布7 1 2 3 组织蛋白酶的研究状况概述8 1 2 4 组织蛋白酶的抑制剂研究简介1 2 1 2 5 组织蛋白酶在鱼类中的研究简介1 3 1 3 本研究的目的和意义1 4 第二章C a t h e p s i nB 的基因克隆、蛋
2、白表达与表达模式分析1 6 2 1 材料与方法1 6 2 1 1 材料1 6 2 1 2 实验方法2 0 2 2 结果与分析3 1 2 2 1 测序结果及序列分析3 0 2 2 2 活性位点、糖基化位点预测及结构域分析3 3 2 2 3 同源比对与进化树构建3 6 2 2 4 构建原核表达载体3 6 2 2 5 重组质粒转入表达菌株4 0 2 2 6 蛋白提取并纯化4 0 2 2 7C a t h e p s i nB 的组织分布与表达分析4 0 2 3 小结与讨论4 4 。羹Z 呈硕士学位论文 第三章C a t h e p s i nL 的基因克隆、蛋白表达与表达模式分析4 7 3 1 材料
3、与方法4 7 3 1 1 材料4 7 3 1 2 实验方法4 7 3 2 结果与分析4 9 3 2 1 测序结果及序列分析4 9 3 2 2 活性位点、糖基化位点预测及结构域分析5 1 3 2 3 同源比对与进化树构建5 5 3 2 4 构建原核表达载体5 9 3 2 5 重组质粒转入表达菌株5 9 3 2 6 蛋白提取并纯化5 9 3 2 7C a t h e p s i nL 的组织分布与表达分析6 0 3 3 小结与讨论6 3 第四章总结6 6 参考文献6 9 致谢7 9 I I t 口 o | 只霉硕士学位论文 C o N T E N T S A b s t r a c t ( C h
4、 i n e s e ) 1 A b s t r a c t ( E n g l i s h ) 3 C h a p t e r1I n t r o d u c t i o n 6 1 1 R e s e a r c ha d v a n c ea b o u tR o u g h s k i nS c u l p i n 6 1 1 1B i o l o g yg e n e r a lo f R o u g h s k i nS c u l p i n 6 1 1 2D i s t r i b u t i o na n d p r o t e c t i o n o f R o u g h
5、 s k i nS c u l p i n 6 1 1 3S c i e n t i f i cr e s e a r c hs i t u a t i o no f R o u g h s k i nS c u l p i n 6 1 2R e s e a r c ha d v a n c ea b o u tc a t h e p s i n s 7 1 2 1O r i g i no f t h en a m e “c a t h e p s i n s ”7 1 2 2C l a s s i f i c a t i o na n dd i s t r i b u t i o no fc
6、 a t h e p s i n s 7 1 2 3R e s e a r c hs i t u a t i o na d v a n c eo f c a t h e p s i n s 8 1 2 4R e s e a r c hs i t u a t i o na b o u ti n h i b i t o r so fc a t h e p s i n s 。1 2 1 2 5R e s e a r c hs i t u a t i o no f c a t h e p s i n si nf i s h 1 3 1 3O b j e c t i v e sa n ds i g n
7、i f i c a n c e so f t h i ss t u d y 1 4 C h a p t e r2G e n ec l o n i n g ，p r o t e i ne x p r e s s i o na n da n a l y s i so fc a t h e p s i nB 16 2 1M a t 舐a l sa n dm e t h o d s 1 6 口 2 1 1M a t e r i a l s 1 6 2 1 2M e t h o d s 1 9 2 2R e s u l t sa n da n a l y s i s 3 0 2 2 1S e q u e
8、 n c ea n a l y s i s 3 0 2 2 2F o r c a s t i n go fa c t i v es i t e s g l y c o s y l a t i o ns i t e sa n da n a l y s i so fs m J c t u r a l d o m a i n 3 3 2 2 3H o m o l o g ya n dp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p 3 6 2 2 4C o n s t r u t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r
9、e s s i o nv e c t o r 3 6 2 2 5R e c o m b i n a n tv e c t o rs w i t c hi n t oB L 2 1 3 9 I I I 乒| 鼻孥硕士学位论文 2 2 6P r o t e i nc o l l e c t i o na n dp u r i f i c a t i o n 3 9 2 2 7D i s t r i b u t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so fc a t h e p s i nB 4 0 2 3D i s s c u s s i o n
10、4 4 C h a p t e r3G e n ec l o n i n g p r o t e i ne x p r e s s i o na n da n a l y s i so fc a t h e p s i nL 4 7 3 1M a t e r i a l sa n dm e t h o d s 4 7 ：；1 1M a t e r i a l s 4 7 3 1 2M e t h o d s 4 7 3 2R e s u l t sa n da n a l y s i s 4 9 3 2 1S e q u e n c ea n a l y s i s 4 9 - 3 2 2F
11、o r c a s t i n go fa c t i v es i t e s ，g l y c o s y l a t i o ns i t e sa n da n a l y s i so fs t r u c t u r a l d o m a i n 51 _ 3 2 3H o m o l o g ya n dp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p 5 5 3 2 4C o n s t r u t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r 5 9 3
12、2 5R e c o m b i n a n tv e c t o rs w i t c hi n t oB L 2 1 5 9 3 2 6P r o t e i nc o l l e c t i o na n dp u r i f i c a t i o n 5 9 3 2 7D i s t r i b u t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so f c a t h e p s i nL 6 0 3 3D i s s c u s s i o n 6 3 C h a p t e r4S u m m a r y 6 6 R e f e r
13、e n c e s 6 9 A c h l o w l e d 脬n e n t s 7 9 - 口 1 - J 一 口 厶| 只季硕士学位论文 中文摘要 松江鲈( T r a c h i d e r m u s f a s c i a t u s ) 为中国“四大名鱼“ 之一，具有较高的经济 价值和营养价值。其成年个体一般体长1 2 1 7 c m ，体重5 0 “ - - 1 0 0 9 ，为肉食性的 小型降海溯河洄游性鱼类。松江鲈以往主要分布在我国的渤海、黄海和东海沿岸 及沿海河流的下游，但是，近十几年来随着我国经济的迅速发展，自然环境受到 了较大破坏，特别是大多数工厂沿河流排污。而松江
14、鲈依赖于江河的入海口进行 生长和繁殖，这无疑大大压缩了它们的生存空间，据目前的资料来看，现仅分布 在鸭绿江、青龙河以及富春江流域。所以，松江鲈已经被列入国家二级保护动物； 同时，我国于2 0 0 7 年1 月在山东省文登市埠口镇的青龙河出海口处建立了首个松 江鲈自然保护区，本实验所用松江鲈即采自此保护区。 组织蛋白酶是一种水解酶，可以降解蛋白质或者多肽片段，使其从氨基酸与 氨基酸之间的肽键处断裂或者专一性的在氨基酸侧链处断裂。“组织蛋白酶“ 的 概念在2 0 世纪2 0 年代提出，关于它的研究则在以后的近一个世纪中迅速发展， 到现在为止，已经发现了几十个种类的组织蛋白酶。组织蛋白酶广泛分布于细
15、菌、 植物和动物中，是新陈代谢中必不可少的酶，它的生物学功能很多，比如参与免 疫应答、降解不需要的蛋白质以维持内稳态、在消化道内消化食物以及降解卵黄 蛋白供给胚胎发育等等，本论文重点研究了其在松江鲈体内的免疫应答作用，获 得了两个重要的组织蛋白酶的e D N A 序列，并以此为基础构建了原核表达载体， 表达并纯化了它们的蛋白；另外，还利用q R T P C R 技术测得了两种组织蛋白酶 在正常情况下和鳗弧菌刺激后在肝脏、鳃、血液和脾脏中的表达模式，并对此进 行了分析，推断这两种酶参与了松江鲈免疫应答的过程。 本论文获得了松江鲈的C a t h e p s i nB 和C a t h e p s
16、 i nL 的核苷酸序列。C a t h e p s i n B 的e D N A 序列全长为1 2 2 6 b p ，5 端非编码区11 8 b p ，3 端非编码区11 5 b p ，有 多聚腺苷酸( p o l y A ) 尾巴和加尾信号( A A T A A ) ，开放阅读框为9 9 3 b p ，编码 3 3 0 个氨基酸，氨基酸序列的N 端有一个1 8 个氨基酸的信号肽，成熟肽中含有 一C a t h e p s i nB 的特有功能区域O c c l u d i n gl o o p ( 含有21 个氨基酸残基) ；C a t h e p s i n L 的e D N A 序列全
17、长为1 4 0 4b p ，5 7 端非编码区5 3 b p ，3 端非编码区3 4 0 b p ，也有 多聚腺苷酸( p o l y A ) 尾巴和加尾信号( A A T A A ) ，开放阅读框为1 0 1l b p ，编码 厶茹只霉硕士学位论文 口 口 厶fZ 互硕士学位论文 A B S T R A C T R o u g h s k i nS c u l p i n ( T r a c h i d e r m u sf a s c i a t u s ) i so n eo ft h ef o u rm o s tf a m o u s f i s h e si n C h i n a
18、 T h e yh a v eh i g he c o n o m i ca n dn u t r i t i o n a lv a l u e B o d yl e n g t ho f r o u g h s k i nS o u l p i ni su s u a l l y12 - 17 c m ，a n dw e i g h ti sa b o u t5 0 10 0 9 R o u g h s k i n S o u l p i nw a su s e dt of i n di nt h eB o h a iS e a ，Y e l l o wS e a ，t h eE a s t
19、C h i n aS e ac o a s t sa n d e s t u a r i e so fs o m er i v e r s T h ee n v i r o n m e n tw a sd e s t r o y e dw i t hr a p i de c o n o m i cg r o w t h o fo u rc o u n t r yi nt h ep a s td e c a d e ，e s p e c i a l l ym a n yf a c t o r i e sd i s c h a r g e ds e w a g ei n t o t h er i
20、v e r s N e v e r t h e l e s s ，r o u g h s k i nS o u l p i nr e l y so nt h eh a b i t a ta te s t u a r i e sa n d p o l l u t i o no fe n v i r o n m e n tc o m p r e s s e st h e i rh a b i t a ti nn od o u b t N o wi td i s t r i b u t e so n l y i nt h eY a l uR i v e r ，Q i n g l o n gR i v
21、 e r 觚dF u c h u nR i v e r R o u g h s l ( i ns o u l p i ni sp r o t e c t e d 口 i no r d e rI Ii nC h i n a T h ef i r s tr e s e r v eo fr o u g h s k i nS o u l p i nw e r eb u i l ta te s t u a r yo f Q i n g l o n gR i v e r , W e n d e n gc i t y , S h a n d o n gP r o v i n c ei nJ a n u a
22、r y ，2 0 0 7 T h er o u g h s k i n S o u l p i ns a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o mt h i sa r e a C a t h e p s i n sb e l o n gt oh y d r o l a s e ，a n dt h e yC a nh y d r o l y z ep r o t e i n so rp e p t i d e sa t s o m es p e c i f i cb i n d i n g s C a t h e p s i nW a sf o u n d
23、i n19 2 0 s ，a n dm a d ear a p i dp r o g r e s sW a s m a d ei nt h ef o l l w i n gc e n t u r y S e v e r a lk i n d so fc a t h e p s i n sw e r ed i s c o v e r e db yn o w C a t h e p s i n sa r ee s s e n t i a li nm e t a b o l i s mi nb a c t e r i a ，p l a n t sa n da n i m a l s T h e yh
24、 a v e m a n yf u n c t i o n s ，f o re x a m p l e ，p l a y i n gar o l ei ni m m u n er e s p o n s e ，d e g r a d i n gp r o t e i n s t om a i n t a i nc e l l u a rh o m e o s t a s i s ，d i g e s t i n gf o o d si na l i m e n t a r yc a n a la n dd e g r a d i n g y o l kp r o t e i n sf o rg
25、 r o w t ho fe m b r y o sa n dS Oo n I no u re x p e r i m e n t sw eo b t a i n e dt h e e D N A s e q u e n c eo fc a t h e p s i nB a n dL ，c o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n t v e c t o r , e x p r e s s e da n d p u r i f i e dm c i rp r o t e i n s I na d d i t i o n ，w ea n a l y s e d
26、t h ee x p r e s s i o no ft w oc a t h e p s i n si n n o r m a lc o n d i t i o na n dc h a l l e n g e dw i t hH b r i oa n g u i l l a r u mi nl i v e r ，g i l l ，b l o o da n d s p l e e nt h r o u g hq R T - P C R T h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc a t h e p s i nB a n dLp l a y e dak
27、 e y - r o l ei ni u m m n er e p o n s eo fR o u g h s k i ns o u l p i n W eo b t a i n e dn u c l e o t i d es e q u e n c eo fc a t h e p s i nBa n dL T h ef u l l l e n g ho f c a t h e p s i nB i s 1 2 2 6 b p I th a sa11 8 b p5 - U T R ，11 5 b p3 - U T Ra n ds i n g l et y p i c a l p o l y a
28、 d e n y l a t i o n T h e9 9 3 b po p e nr e a d i n gf r a m e ( O R F ) e n c o d e s3 3 0a m i n oa c i d s T h e N t e r m i n a lo fa m i n oa c i d ss e q u e n c ec o n t a i n sa18a as i n g a lp e p t i d e s ，a n dt h em a t u r e 3 厶| 兵季硕士学位论文 p e p t i d ec o n t a i n sap r o p e rf u
29、n c t i o n a la r e a ，2 1a ao c c l u d i n gl o o p C a t h e p s i nLh a sa 1 4 0 4 b pf u l l - l e n g hc D N A ，a5 3 b p5 - U T R ，a3 4 0 b p3 - U T Ra n ds i n g l et y p i c a l p o l y a d e n y l a t i o n T h e 10 1l b pO R Fe n c o d e s3 3 6a m i n oa c i d s T h eN t e r m i n a lo f
30、a m i n oa c i d ss e q u e n c ea l s oc o n t a i n sa s i n g a lp e p t i d e s ，b u ti ti s16a a I na d d i t i o n ，i th a s aI n h i b i t o r 1 2 9a r e a ，a nE R F W N I Nm o t i fa n dE Fh a n dC a + b i n d i n ga r e a T h er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h ec a t h e p s i nL b e
31、l o n g st oc a l m o d u l i n W e a n a l y s e dt h ee x p r e s s i o no ft w oc a t h e p s i n su s i n g1 3 - a c t i nt h r o u g hq R T P C R m R N Ao fc a t h e p s i nBa n dL u b i q u i t o u s l ye x p r e s s e di na l la n a l y z e dt i s s u e s ，n a m e l y b l o o d ，h e a r t ，l
32、i v e r ，g i l l ，i n t e s t i n e ，s k i n ，k i d n e y , s p l e e n ，b r a i na n do v a r y T h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h et w oc a t h e p s i n sm i g h tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nm e t a b o l i s m O nt h e o t h e rs i d e ，t h i se x p e r i m e n td e t e r m
33、i n e dt h er e l a t i v ee x p r e s s i o no fl i v e r ，g i l l ，b l o o da n d s p l e e nw i t hp o s t - i n j e c t i o na td i f f e r e n tt i m e s ，lh ，2 h ，6 h ，12 h ，2 4 h ，4 8 ha n d7 2 h T h e u p r e g u l a t i o na tlha n d2 hi n d i c a t e dt h a tc a t h e p s i nBa n dLh a da
34、ne x t r e m e l yp o s s i b l e k e yf u n c t i o ni ni m m u n er e s p o n s eo fR o u g h s k i ns o u l p i n C a t h e p s i nB a n dLa r ei m m u n e - r e l a t e de n z y m e sl i k eo t h e rs t u d i e da n i m a l s T h e a c h i e v e m e n to fc D N A s e q u e n c e ，a n a l y s i s
35、o f p r o t e i ns t r u c t u r e ，f o r e c a s t i n go ff u n c t i o n a n dd i s c u s s i o no fe x p r e s s i o nc o u l dp r o v i d e dt h ef i r s t - h a n di n f o r m a t i o nf o rd i s e a s e c o n t r o la n dd o m e s t i c a t i o no fR o u g h s k i ns o u l p i n 口 K e yw 。r d
36、 s ：R o u 曲s k i ns 。u l p i n ( 幽沈册淞加c 励船) ，c a m 印s i nB ，c a m 印s i nL ， g e n ec l o n i n g ，e x p r e s s i o n 4 r 1 L r - - o 口 口 of 只互硕士学位论文 园匾 缩写英文名 中文名 A c r A P S A m p B i s b p d N T P E c o l i E D T A m l n h m M N J I P T G S D S P A G E P C R r p m T E M E D A c r y l a m i d e A m
37、 m o n i u mp e r s u l f a t e A m p i c i l l i n B i s a c r y l a m i d e B a s ep a i r 丙烯酰胺 过硫酸铵 氨苄青霉素 N ，N 一亚甲基双丙烯酰 胺 碱基对 D e o x y - r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e三磷酸脱氧核( 糖核) 苷 E s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d乙二
38、胺四乙酸 m i n u t e h o u r m m 0 1 L N e i g h b o rj o i n i n g I s o p r o p y lD D t h i o g a l a c t o s i d e 分钟 小时 毫摩尔每升 邻接法 异丙基硫代一1 3 - D 半乳 糖苷 S o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 P o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 P o l y m e r a s ec h a i nr e
39、 a c t i o n多聚酶链式反应 R e v o l u t i o np e rm i n u t e 辕 食 N ，N ，N ，N - T e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e四甲基乙烯基二胺 5 厶茹夕；客硕_ J ：学位论文 第一章文献综述 1 1 松江鲈的研究情况介绍 1 1 1 松江鲈的生物学概况 松江鲈( T r a c h i d e r m u sf a s c i a t u s ) 按照动物学分类属于鲇形目 ( S c o r p a e n i f o r m e s ) ，杜父鱼科( C o t t
40、i d a e ) ，松江鲈属( T r a c h i d e r m u s ) 【l 】，又名四鳃鲈、 媳妇鱼、新娘鱼、花鼓鱼、伏念鱼等，一般生活在水体底层。它与兴凯湖鲐( C u l t e r a l b u r n u s ) 、黄河鲤鱼( C y p r i n u sc a r p i o ) 和松花江鳜鱼( O n c o r h y n c h u sk e t a ) 合 称为中国“四大名鱼” 2 1 ，松江鲈肉质鲜美，具有较高的经济价值和营养价值。 松江鲈的鱼体呈纺锤形，无鳞。成年个体一般体长1 2 1 7 c m ，体重5 0 ，- 1 0 0 9 ， 为肉食性的小型
41、降海溯河洄游性鱼类，以原生动物、水生昆虫、底栖动物、虾类 和鱼类等为食【3 】，鱼苗在每年4 月下旬到6 月上旬从海水中游到通海的河口，并逐 渐游至内陆的河水水域进行摄食和长成，当性腺发育成熟后，松江鲈开始向河口 生殖洄游，最终在海洋中繁殖孵化【4 】。 1 1 2 松江鲈的历史分布与保护现状 松江鲈的名称来源于它曾经的栖息地之一上海市松江区( 现已绝迹) 。 历史上此种鱼类的分布非常广泛，在我国的渤海、黄海和东海沿岸及沿海河流的 下游都有分布，属于习见鱼类【5 1 ，在国外则见于朝鲜半岛和日本南部。但是，由 于近代经济、工业和水利等的发展，松江鲈的生存环境大大恶化，分布区域急剧 缩小，现在仅
42、在鸭绿江、青龙河以及富春江流域发现有松江鲈的分布【6 1 。鉴于此， 松江鲈已经被列入国家二级保护动物【7 】；为了保护这种濒临绝灭的鱼类，我国还 于2 0 0 7 年1 月在山东省文登市埠口镇的青龙河出海口处建立了首个松江鲈自然保 护区，以进行种质资源的保护和松江鲈的人工驯养。 1 1 3 松江鲈的科学研究情况介绍 关于松江鲈的基础研究由来已久，已有几十年的历史。但是初始的研究主要 6 口 口 口 e 口 厶f 只署硕士学位论文 集中在生物学、生态学和生理学以及繁殖研究方面【8 。4 1 ，几经发展，现在已偏向 于繁殖生物学和保护遗传学的研究 1 5 - 2 0 】。由于松江鲈的地域分布局限
43、性，国际上 研究的较少，而国内关于松江鲈的免疫学研究则仅见于刘莹莹等的研究。可 见，从免疫学角度对松江鲈进行充分的相关研究，尚属空白。 1 2 组织蛋白酶的研究情况介绍 按照酶所催化反应的类型，可以将酶分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、 合成酶类、水解酶类、裂合酶类和异构酶类。蛋白酶( P r o t e a s e ) 属于这六大类 中的水解酶类，其生物学功能主要是降解蛋白质或者多肽片段，使其从氨基酸与 氨基酸之间的肽键处断裂或者专一性的在氨基酸侧链处断裂。蛋白酶参与生物体 内的多种生物化学反应，例如酶原激活、抗原呈递和食物的消化，是各种生物体 内必不可少的酶之一。 1 2 1 组织蛋白酶名称的由来 “组织蛋白酶“ 一词来源于希腊语“消化”，最初只是作为一个术语来称呼一 些消化酶，这些酶的最