氡与亚砷酸钠对HBE细胞联合毒性作用研究.pdf

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1、氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 中文摘要中文摘要 I 中文摘要 目的 探讨氡与亚砷酸钠染毒永生化人上皮细胞（HBE cells）联合作用类型及 联合染毒对 HBE 细胞氧化损伤和 DNA 损伤的影响。 方法（1）以 HBE 细胞为研究对象，将 HBE 细胞单独暴露于 20000Bq/m3 的 氡染毒不同时间（075 min） 、不同剂量（050000mol/L）的亚砷酸钠以及二者 的联合染毒，采用活细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率。通过中效原理计算 不同时间氡暴露和不同剂量亚砷酸钠染毒联合作用的联合指数（combination inde

2、x，CI） 。 （2）以不同时间氡暴露（20000 Bq/m3，10、20 和 40 min）和不同浓 度亚砷酸钠（1.5、3.0 和 6.0mol/L）处理 HBE 细胞，测定氡、亚砷酸钠单独及联 合 染 毒 后， HBE 细胞 活 性 氧（ reactive oxygen species ， ROS ） 、 丙 二 醛 （malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxi dismutase，SOD）活 力的变化；通过彗星实验检测氡、亚砷酸钠单独及联合染毒后 HBE 细胞的 DNA 损伤情况； （3）通过 Western blot 检测在氡、亚砷酸钠单独及联合染

3、毒后 24 小时， DNA 损伤蛋白 H2AX 和 DNA 修复蛋白 Rad51。 结果 （1）氡与亚砷酸钠单独或联合染毒对 HBE 细胞均有抑制作用；不同时 间氡暴露和不同剂量亚砷酸钠联合染毒的联合指数 CI1，分别表示两种药物联合作用的结果为协同作用、相加作用和拮抗作用。CI 指数采用 Calcusyn 软件计算。 1.2.5 统计分析 实验数据均以 x s 进行表示。采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。多组间比 较采用方差齐性检验和单因素方差分析 （One Way ANOVA） 。 进一步进行组间两两 比较时， 若方差齐时， 采用 SNK 检验 （Student-Newman-

4、Keuls 法） ； 若方差不齐时， 采用 Games-Howell 检验。率间比较采用 2检验。以 P1 拮抗作用，CI=1 相加作用，CI1） 。 中效方程25： 注： a为抑制率，u为存活率，D 为剂量，m 为斜率 CI 计算方程25： 方程中分母(Dx)1代表当 1 药单独作用时抑制率为 x%时所用剂量，(Dx)2代表当 2 药单独作用时抑制率为 x%时所用剂量；分子(D)1和(D)2代表 1 药和 2 药联合作用 时抑制率为 x%时所用剂量。 本实验结果显示氡单独染毒和亚砷酸钠单独染毒对 HBE 细胞生长均存在抑制 作用，且与氡暴露时间和亚砷酸钠剂量存在剂量反应关系（表 1.1、表

5、1.2） ；联合 第第一一部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 10 染毒组也呈现对 HBE 细胞明显的生长抑制作用（表 1.3） 。如图 1.1 所示，氡与亚 砷酸钠联合染毒 HBE 细胞时，CI1 表明氡与亚砷酸钠具有明显的协同毒性作用。 确定氡与亚砷酸钠联合作用的类型，可为后续进一步实验提供依据。 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第二二部分部分 11 第二部分 氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞氧化损伤的联合 毒作用 第一部分实验结果显示，氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞具有协同抑制细胞生长作 用

6、。但二者是如何对 HBE 细胞产生联合毒性作用，还有待进一步研究。由于氡与 亚砷酸钠均可对机体造成氧化损伤，所以本部分通过对 HBE 细胞进行不同时间氡 暴露和不同浓度亚砷酸钠单独和联合染毒，探讨二者单独和联合染毒对 HBE 细胞 氧化损伤的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 氯化钠（NaCl） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 氯化钾（KCl） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钾（KH2PO4） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 二甲亚砜（DMSO） 中国上海国药集团化学试剂有限公司

7、 无水乙醇 中国上海国药集团化学试剂有限公司 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-2Na） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 亚砷酸钠 （NaAsO2） 德国 Merck 公司 DMEM 培养基 加拿大 Wisent 公司 0.25%胰蛋白酶 加拿大 Wisent 公司 胎牛血清 加拿大 Wisent 公司 青链霉素 加拿大 Wisent 公司 BCA(BicinChoninic Acid)法蛋白浓度定 量试剂盒 美国 Thermo 公司 活细胞计数测试剂盒（Cell Counting Kit-8 ，CCK-8 日本 Dojindo 公司 ROS 检测试剂盒 中国碧云天生物技术研究所 超氧化物歧化酶

8、（superoxi dismutase， SOD）检测试剂盒 中国南京建成生物工程研究所 第第二二部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 12 丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试 剂盒 中国南京建成生物工程研究所 1.1.2 主要仪器 多功能生态氡室 中国华东地质学院制造 5415 R 型低温高速离心机 德国 Eppendorf 公司 -80低温冰箱 美国 Thermo 公司 3111 型 CO2恒温培养箱 美国 Thermo 公司 不同规格微量加样器 德国 Eppendorf 公司 BD FACSCalibur 型流式细胞

9、仪 美国 BD Bioscience 公司 Power Wave XS 酶标仪 美国 BIO TEK 公司 电子天平 日本岛津公司 MI11 型倒置显微镜 日本 Olympus 公司 756 紫外可见分光光度计 中国上海光谱仪器有限公司 BSZ-2 型自动双重蒸馏水器 中国上海博通公司 全自动高压消毒锅 中国上海申安医疗器械厂 电热恒温水浴锅 中国上海精宏实验设备有限公司 1.1.3 细胞株 HBE 细胞由中山大学惠赠。 1.2 实验方法 1.2.1 主要试剂配制 1.2.1.1 亚砷酸钠配制 将适量的亚砷酸钠溶于 DMEM 培养液中配制成 50 mmol/L 的亚砷酸钠溶液作 为原液，然后用

10、 DMEM 培养基将原液稀释到所需浓度。 1.2.1.2 DMEM 培养基配制 在 DMEM 培养基中加入 10%的胎牛血清，同时加入青链霉素溶液，使其终浓 度为 100 U/mL，放置 4冰箱备用。 1.2.1.3 磷酸盐缓冲液（PBS）配制 称取 NaCl 8 g，KCl 0.2 g， Na2HPO4 12H2O 3.4 8 g，KH2PO4 0.2 g 于烧杯中， 加入 900 mL 双蒸水， 待溶解后定容至 1000 mL， 调节 PH 值为 7.4。 高压灭菌备用。 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第二二部分部分 13 1.2.2 细

11、胞培养 HBE 细胞在 5% CO2、37 条件下，常规培养于 DMEM 培养基（含 10%胎牛 血清）中，待细胞处于生长对数期时，收集细胞，备用。 1.2.3 细胞内 ROS 检测 将处于生长对数期的 HBE 细胞按实验设计染毒，于染毒后 24 小时使用 0.25% 胰蛋白酶消化收集细胞，使用 PBS 洗涤细胞一次待用。按照 1:1000 用无血清培养 液稀释荧光探针 DCFH-DA，使终浓度为 10mol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中，细胞浓度为 1 1062 107/mL，37细胞培养箱内孵育 20 分钟。每 隔 3-5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血

12、清细胞培养液洗涤细胞 三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。采用流式细胞仪检测 ROS 的含量。 1.2.4 细胞内 SOD 和 MDA 含量检测 1.2.4.1 细胞内总蛋白提取 HBE 细胞经过染毒处理 24 小时后，弃去含受试物的 DMEM 培养基，用 4 预冷的 PBS 漂洗 2 遍后，尽量吸干残余 PBS。加入胰蛋白酶消化，待细胞脱落后 加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化， 收集细胞于1.5 mL EP管中， 1000 r/min 离心 5 分钟，再加入 4预冷的 PBS 漂洗 1 遍弃掉 PBS 后，加入 0.2 mL 的 PBS 打匀。将 EP 管置于冰水混合

13、液中于超声粉碎仪上以 10 秒/次间隔 10 秒的频率反 复破碎 3 次。4 12000 r/min 离心 15 分钟，吸取上清液待测。 1.2.4.2 BCA 法检测细胞蛋白含量 1)样品稀释：将待测样品稀释 10 倍，如取样品 6 L 样品溶于 54 L 的PBS 中。 2)按下表配制标准曲线 组别 标准品浓度（g/mL） BSA（L） PBS 含量（L） A 2000 300 0 B 1500 375 125 C 1000 325 325 D 750 B 溶液中取 175 175 E 500 C 溶液中取 325 325 F 250 E 溶液中取 325 325 G 125 F 溶液中取

14、 325 325 第第二二部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 14 H 25 G 溶液中取 100 400 I 0 0 400 3)将标准品和稀释好的样品以每孔 25 L 加入到 96 孔板中，然后每孔加入工 作液（A:B=50:1）200 L，37孵育 30 分钟。 4)使用酶标仪于波长 562nm 处，读取荧光值。 1.2.4.3 细胞内 SOD 测定 孔别 加入物 对照孔 对照空白孔 测定孔 测定空白孔 样本溶液 - - 20 L 20 L 双蒸水 20 L 20 L - - 酶工作液 20 L - 20 L - 酶稀释液 - 20

15、L - 20 L 底物应用液 200 L 200 L 200 L 200 L 混匀，37孵育 20 分钟，450 nm 处酶标仪读数。 计算公式及定义： 1)定义： 在本反应体系中 SOD 抑制率达 50%时所对应的酶量为一个 SOD 活力 单位（U） 。 2)细胞样本中计算公式： 按公式计算 SOD 的抑制率： 按公式计算 SOD 的活力： 1.2.4.4 细胞内 MDA 测定 标准管 标准空白管 测定管 测定空白管 10n mol/mL 标准品（mL） 0.2 - - - 无水乙醇（mL） - 0.2 - - 测试样品（mL） - - 0.2 0.2 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE

16、细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第二二部分部分 15 试剂一（mL） 0.2 0.2 0.2 0.2 混匀 试剂二（mL） 3 3 3 3 试剂三（mL） 1 1 1 - 50%冰醋酸（mL） - - - 1 旋涡混匀器混匀， 试管口用保鲜薄膜扎紧， 用针头刺一小孔， 96 水浴 40 分钟， 取出后流水冷却，532 nm 处，1cm 光径，蒸馏水调零，测管吸光度值。 计算公式： 1.2.5 统计分析 实验数据均以 x s 进行表示。采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。多组间比 较采用方差齐性检验和单因素方差分析 （One Way ANOVA） 。 进一步进行组间两两 比

17、较时， 若方差齐时， 采用 SNK 检验 （Student-Newman-Keuls 法） ； 若方差不齐时， 采用 Games-Howell 检验。率间比较采用 2检验。以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 氡浓度为 20 000 Bq/m3暴露不同时间与亚砷酸钠单独染毒和联合染毒对 HBE 细胞 ROS、SOD 和 MDA 的影响 在单独染毒的条件下，与对照组相比，氡染毒各组 ROS 和 MDA 的含量均随 氡暴露时间延长显著增高，SOD 活力均显著下降，差异有统计学意义（P0.05） ； 亚砷酸钠染毒各组细胞内ROS和MDA含量均随亚砷酸钠剂量不断加大明显升高， SOD

18、 活力均显著下降，差异有统计学意义（P0.05） 。且随着氡暴露时间延长和亚 砷酸钠染毒剂量的增加， HBE 细胞内 MDA 和 ROS 含量均呈明显的上升趋势， SOD 活力呈明显的下降趋势。 （如表 2.1、2.2、2.3） 。在联合染毒的条件下，分别在氡 暴露时间恒定以及亚砷酸钠剂量恒定的条件下，各联合染毒组 HBE 细胞 ROS 和 MDA 的含量均明显增加（P0.05） ；SOD 活力均显著下降（P0.05） 。 第第二二部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 16 表2.1 氡浓度为20 000Bq/m3不同暴露时间与亚砷酸钠不同剂

19、量单独和联合染毒对 HBE 细胞内 ROS 含量的影响（x s） ROS 含量 氡暴露时间（min） 0 10 20 40 亚砷酸钠 （mol/L） 0 222.09 3.79 305.62 2.34* 357.95 2.02* 392.44 0.92* 1.5 291.08 3.94* 596.21 2.16*ab 653.45 4.17*cb 682.11 3.34*eb 3 345.80 2.46* 655.16 3.97*ad 707.39 3.94*cd 735.93 5.57*ed 6 381.39 3.00* 681.35 8.29*af 742.55 3.33*cf 772.9

20、2 3.43*ef 注：*与空白对照组（0 min+0mol/L）比较，P0.05；a与氡单独染毒组（10 min）比较， P0.05；b与亚砷酸钠单独染毒组（1.5mol/L）比较，P0.05；c与氡单独染毒组（20 min）比 较，P0.05；d 与亚砷酸钠单独染毒组（3mol/L）比较，P0.05；e与氡单独染毒组（40 min） 比较，P0.05；f与亚砷酸钠单独染毒组（6mol/L）比较，P0.05。相关性分析：rRn=0.933， P 0.05；rAs=0.978，P0.05 。析因设计方差分析联合染毒组比较：F=3.035，P0.05。 表2.2 氡浓度为20 000Bq/m3不

21、同暴露时间与亚砷酸钠不同剂量单独和联合染毒对 HBE 细胞内 MDA 含量的影响（x s） MDA 含量 (mmol/ml Pro) 氡暴露时间（min） 0 10 20 40 亚砷酸钠 （mol/L） 0 109.63 1.23 153.59 1.04* 211.45 1.50* 268.79 1.44* 1.5 144.82 1.11* 298.16 4.32*ab 355.68 2.75*cb 415.50 3.25*eb 3 192.77 1.99* 346.27 2.94*ad 405.56 1.56*cd 462.40 3.25*ed 6 230.43 1.37* 383.68 2

22、.00*af 444.07 2.93*cf 497.38 1.78*ef 注：*与空白对照组（0 min+0mol/L）比较，P0.05；a与氡单独染毒组（10 min）比较， P0.05；b与亚砷酸钠单独染毒组（1.5mol/L）比较，P0.05；c与氡单独染毒组（20 min）比 较，P0.05；d 与亚砷酸钠单独染毒组（3mol/L）比较，P0.05；e与氡单独染毒组（40 min） 比较，P0.05；f与亚砷酸钠单独染毒组（6mol/L）比较，P0.05。相关性分析：rRn=0.988， P 0.05；rAs=0.948，P0.05。析因设计方差分析联合染毒组比较： F=2.566，P

23、0.05。 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第二二部分部分 17 表2.3 氡浓度为20 000Bq/m3不同暴露时间与亚砷酸钠不同剂量单独和联合染毒对 HBE 细胞内 SOD 活力的影响（x s） SOD 活力(U/mg Pro) 氡暴露时间（min） 0 10 20 40 亚砷酸钠 （mol/L） 0 284.84 2.15 255.09 1.59* 216.28 0.87* 182.86 1.02* 1.5 264.02 1.92* 231.01 3.61*ab 212.03 2.97*cb 177.71 2.78*eb 3 223.80

24、 2.06* 221.19 5.40 *ad 210.33 1.60*cd 179.58 2.59 *ed 6 198.49 1.34* 174.56 1.68 *af 156.66 2.09*cf 143.89 2.56 *ef 注：*与空白对照组（0 min+0mol/L）比较，P0.05；a与氡单独染毒组（10 min）比较， P0.05；b与亚砷酸钠单独染毒组（1.5mol/L）比较，P0.05；c与氡单独染毒组（20 min）比 较，P0.05；d 与亚砷酸钠单独染毒组（3mol/L）比较，P0.05；e与氡单独染毒组（40 min） 比较，P0.05；f与亚砷酸钠单独染毒组（6mo

25、l/L）比较，P0.05。相关性分析：rRn =-0.982， P 0.05；rAs =-0.972，P0.05。析因设计方差分析联合染毒组比较：F=2.261，P0.05。 3 讨论 氧化损伤是许多外源化合物导致机体毒性作用的主要早期分子机制之一。人 类正常机体代谢过程中，可不断产生 ROS，但在机体抗氧化系统作用下，自由基 又不断地被清除，从而维持一个动态平衡。当外源性化学物进入机体后，引起自 由基和 MDA 的大量生成，抗氧化系统被抑制，自由基和 ROS 不能及时清除，从 而导致大量的自由基和 ROS 游离于机体的脂质、 DNA 和蛋白质等生物大分子之间 进行配对反应，造成机体生物大分子

26、、细胞结构和组织的氧化损伤26。SOD 是酶 促体系中最重要的抗氧化酶之一，能清除多余的自由基，以维持机体的正常生理 作用。 MDA 为脂质过氧化产物之一， 其含量常可以反映机体内脂质过氧化的程度， 间接地反映出细胞损伤的程度。 氡及其子体被认为是继吸烟之后肺癌发生的第二大危险因素，是非吸烟者的 最主要危险因素。从本世纪 60 年代末期首次发现室内氡的危害至今，发现氡对人 体的辐射伤害占人体一生中所受到的全部辐射伤害的 55%以上，其诱发肺癌的潜 伏期大多都在 15 年以上，世界上有 1/5 的肺癌患者与氡有关27-29。氡对人类损伤 效应表现为确定性效应和随机效应，确定性效应在实践中，未见人

27、类吸入氡及其 子体引起的急性损害的例子。只有给动物吸入高浓度氡时，才能引起急性损害。 随机效应主要表现为肿瘤的发生30。氡及其子体衰变产生的 粒子在吸入者体内 第第二二部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 18 产生内照射，对 DNA 造成直接损伤和间接损伤，间接损伤即产生大量自由基对 DNA 造成氧化损伤，进而可诱发癌症的发生。本实验研究发现，随氡暴露时间的 延长 MDA 和 ROS 含量显著增加，SOD 含量下降与氡的暴露时间呈现负相关。提 示氡诱导 HBE 细胞产生大量自由基，从而对 HBE 细胞造成间接损伤。 砷致癌的具体机制至今仍不

28、明确，针对砷致癌机制存在许多假说，其中的氧 化应激学说是由日本学者 Yamanaka 于 20 世纪 90 年代提出的。Yamanaka 等31研 究发现，经口高剂量（1500 mg/kg）的二甲基胂酸（dimethylarsenic acid，DMA） 染毒可以诱发 ICR 雄性小鼠肺组织严重的 DNA 损伤，且这些 DNA 损伤与 SOD 和过氧化氢含量相关。现今越来越多的实验证据表明，诱发氧化应激是砷毒性作 用的主要机制32-35。Ding 等32研究发现，人永生化角质形成细胞（The human keratinocyte cell line，HaCaT）中 8-羟基脱氧鸟苷（8-hyd

29、roxy-2-deoxyguanosine， 8-OHdG）和 3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）的含量与三价砷的含量呈现明 显的正相关。姚芹等33研究发现随着亚砷酸钠染毒剂量的增加，小鼠肝脏和大脑 组织中 MDA 含量增加，SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶活力降低。薛鹏等34研究发 现亚砷酸钠可以引起人膀胱上皮永生化细胞（S-HUC-1 细胞）各染毒组 ROS 水平 显著升高，SOD 活力显著降低。陆景坤等35研究发现三价砷可致人胚肾细胞系生 存率下降，MDA 含量升高 SOD 活力下降。本实验结果也显示，与对照组比较， 亚砷酸钠染毒 HBE 细胞内 ROS、MDA 含量

30、均显著升高，SOD 活力显著下降；且 随着亚砷酸钠染毒浓度的升高，HBE 细胞内 MDA 和 ROS 含量均呈明显的上升趋 势， SOD 活力呈明显的下降趋势。 与单独氡染毒组和单独亚砷酸钠染毒各组比较， 联合染毒组 HBE 细胞内 ROS 和 MDA 含量明显增加，SOD 活力明显下降。提示氡与亚砷酸钠联合染毒对 HBE 细胞造成的氧化损伤具有明显的协同作用。通过析因分析氡与亚砷酸钠联合作用， 发现氡与亚砷酸钠联合染毒对 HBE 细胞 ROS、 SOD 和 MDA 的影响中均存在交互 作用。虽然析因分析并不能明确联合作用的类型，但通过析因分析进一步印证了 中效原理所得结果。 综上所述，氡与亚

31、砷酸钠具有明显的协同作用，二者联合染毒对 HBE 细胞造 成明显氧化损伤，诱导 HBE 细胞内自由基的生成量增加，抗氧化能力降低，使细 胞的氧化和抗氧化平衡破坏，从而进一步导致 HBE 细胞的 DNA 损伤。 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第三三部分部分 19 第三部分 氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞 DNA 损伤和修复 的联合毒作用 第二部分研究结果发现，氡与亚砷酸钠联合染毒可引起 HBE 细胞 ROS 大量 生成，SOD 活力明显下降，从而对 HBE 细胞造成严重的氧化损伤。正常人生理状 态下，自由基的产生与清除的过程是一个动态平衡。当外源

32、化学物或其他物质进 入机体后，刺激自由基在体内大量生成，且清除自由基的抗氧化系统被抑制，从 而大量的自由基异常增加，导致了氧化性 DNA 损伤累积。在本部分探讨氡与亚砷 酸钠联合对 HBE 细胞 DNA 损伤和修复的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 氯化钠（NaCl） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 氯化钾（KCl） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钾（KH2PO4） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 二甲亚砜（DMSO） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇 中国上海国药集

33、团化学试剂有限公司 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-2Na） 中国上海国药集团化学试剂有限公司 甲醇 中国上海国药集团化学试剂有限公司 甘氨酸 中国碧云天生物技术研究所 十二烷基磺酸钠（SDS） 中国碧云天生物技术研究所 过硫酸铵（AP） 中国碧云天生物技术研究所 四乙基乙二胺（TEMED） 中国碧云天生物技术研究所 Tween 20 中国碧云天生物技术研究所 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 中国碧云天生物技术研究所 亚砷酸钠 （NaAsO2） 德国 Merck 公司 第第三三部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 20 DMEM 培养基 加拿大

34、Wisent 公司 0.25%胰蛋白酶 加拿大 Wisent 公司 胎牛血清 加拿大 Wisent 公司 青链霉素 加拿大 Wisent 公司 BCA(BicinChoninic Acid)法蛋白浓度定 量试剂盒 美国 Thermo 公司 预染蛋白质分子量 Marker 美国 Thermo 公司 RIPA 裂解液 中国碧云天生物技术研究所 苯甲基磺酰氟（PMSF） 中国碧云天生物技术研究所 PhosSTOP 磷酸酶抑制剂 瑞士罗氏公司 小鼠抗人 Rad51 单克隆抗体 美国 Abcam 公司 小鼠抗人 H2AX 单克隆抗体 美国 Abcam 公司 兔抗人 GAPDH 多克隆抗体 中国杭州贤至生

35、物科技有限公司 HRP 标记羊抗小鼠 IgG 抗体 美国 Abcam 公司 HRP 标记羊抗兔 IgG 抗体 美国 Abcam 公司 正常熔点琼脂糖（NMA） 美国 Gibco 公司 低熔点琼脂糖（LMA） 美国 Gibco 公司 溴化乙啶（EB） 美国 Sigma 公司 多功能生态氡室 中国华东地质学院制造 5415 R 型低温高速离心机 德国 Eppendorf 公司 -80低温冰箱 美国 Thermo 公司 3111 型 CO2恒温培养箱 美国 Thermo 公司 不同规格微量加样器 德国 Eppendorf 公司 电子天平 日本岛津公司 MI11 型倒置显微镜 日本 Olympus 公

36、司 756 紫外可见分光光度计 中国上海光谱仪器有限公司 BSZ-2 型自动双重蒸馏水器 中国上海博通公司 全自动高压消毒锅 中国上海申安医疗器械厂 电热恒温水浴锅 中国上海精宏实验设备有限公司 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第三三部分部分 21 1.1.2 细胞株 同第一部分。 1.2 实验方法 1.2.1 主要试剂配制 1.2.1.1 亚砷酸钠配制 将适量的亚砷酸钠溶于 DMEM 培养液中配制成 50 mmol/L 的亚砷酸钠溶液作 为原液，然后用 DMEM 培养基将原液稀释到所需浓度。 1.2.1.2 DMEM 培养基配制 在 DMEM

37、 培养基中加入 10%的胎牛血清，同时加入青链霉素溶液，使其终浓 度为 100 U/mL，放置 4冰箱备用。 1.2.1.3 磷酸盐缓冲液（PBS）配制 称取 NaCl 8 g，KCl 0.2 g， Na2HPO4 12H2O 3.4 8 g，KH2PO4 0.2 g 于烧杯中， 加入 900 mL 双蒸水， 待溶解后定容至 1000 mL， 调节 PH 值为 7.4。 高压灭菌备用。 1.2.2 细胞培养 HBE 细胞在 5% CO2、37 条件下，常规培养于 DMEM 培养基（含 10%胎牛 血清）中，待细胞处于生长对数期时，收集细胞，备用。 1.2.3 彗星实验 取处于对数生长期的细胞制

38、备单细胞悬液，以每孔 1 105/ml 的密度接种于 Transwell 培养皿内，每孔加入 DMEM 培养基 1.5 ml。待细胞贴壁 24 h 后，将 Transwell 培养皿置于细胞气体染毒装置染毒，培养基雾化保持细胞湿润，氧气浓 度 21%，流量 10 ml/min。氡染毒后立即加入含不同浓度亚砷酸钠培养基。染氡剂 量为 20 000 Bq/m3，时间分别为 10、20 和 40 min。亚砷酸钠染毒剂量为 1.5、3.0 和 6.0 mol/L。染毒 24 h 后收样待测。取正常熔点琼脂糖（NMA）110 l 滴在毛 玻璃上作为第一层，盖上盖玻片，4 下冷却 10 min；第二层：

39、将细胞悬液加入 150 l 低熔点琼脂糖（LMA）中，吸取 75 l 铺在第一层上，盖上盖玻片，4 冷 却 10 min。揭去盖玻片，将玻片放入裂解液中，置于 4 裂解 90 min；将玻片从 裂解液中取出，放入电泳槽内，倒入电泳液，静置解旋 30 min；电泳 30 min 后， 在玻片上滴加 5 mg/L 溴化乙啶（EB）溶液 50 l，荧光显微镜下观察 50 个细胞， 用 CASP 软件分析结果，用尾部 DNA 百分含量、尾距和 Olive 尾矩来判断 DNA 第第三三部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 22 损伤强度。 1.2.4

40、Western blot 实验步骤 1.2.4.1 细胞染毒 1.2.4.2 蛋白提取及定量 1） 常温下配制裂解缓冲液，RIPA 10ml ，phosphat（磷酸酶抑制剂）1 片， 置于-80保存。 2） 收集细胞，用 PBS 洗两遍，弃掉 PBS，加入蛋白裂解液和 PMSF 的混合 液 50-100l，冰上孵育 30-40min，孵育后在 4 12000 rpm 离心 15min 取上清。 3） 蛋白定量 根据 BCA 蛋白定量法，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准，选择 1500，1000， 750，500，250，125，25 和 0g/ml 作标准曲线。细胞样品提取后，按照 BCA

41、蛋 白定量试剂盒于 595nm 处测定吸光度值，按照标准曲线中得到的回归方程求得各 组细胞蛋白浓度，并算出 40g 上样量分别需要的样品体积，配制上样混合体系， 其中上样缓冲液（Loading buffer）占上样总体积的 1/5，煮沸变性 5 分钟。 1.2.4.3 Western blot 检测 1.2.4.3.1 溶液配制 1）SDS 上样缓冲液，5 （loading buffer）10ml 1M（pH6.8）Tris-HCI 0.6 ml DTT 0.5 m 10% SDS 2 ml 1% 溴酚蓝 1 ml 5% 甘油 5 ml 双蒸水 0.9 ml 2）10 电泳缓冲液（PH=8.3

42、） Tris 15.1 g 甘氨酸 72.1 g SDS 5 g 双蒸水 500 ml 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第三三部分部分 23 3）转膜缓冲液 甘氨酸 14.4 g 1 mol/L Tris（PH=8.3） 25 ml 甲醇 200 ml 10% SDS 4 ml 双蒸水 定容至 1000 ml 4）10 TBS 缓冲液（PH=7.6） Tris 24 g NaCl 80 g 双蒸水 1000 ml 5）TBST 缓冲液 Tween 20 0.5 ml 10 TBS 缓冲液（PH=7.6） 100 ml 双蒸水 定容至 1000

43、ml 6）封闭液 脱脂奶粉 5 g TBST 100 ml 溶解后 4保存，使用时恢复至室温。 1.2.4.3.2 电泳 配置 12%分离胶与 5%浓缩胶，每孔上样量 40g，样品在浓缩胶中以 90V 电压 跑至分离胶界面上端，调至 110V 进行蛋白电泳分离，时间视 Marker 条带位置而定。 1.2.4.3.2 转膜 电泳结束前配制转移缓冲液，准备双层滤纸，将 PVDF 膜剪成合适大小泡入 甲醇中约 2 分钟，再转入转移缓冲液中。电泳停止小心取下胶块，按海绵/滤纸、 胶、膜、滤纸和海绵的顺序制好“转膜三明治”，玻璃棒轻碾赶走气泡。装入电转移 仪进行转膜。转膜电压 110V，转移 1.5h

44、。 第第三三部分部分 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 24 1.2.4.3.3 抗体孵育 转膜完成后将膜用 5%脱脂奶粉 4封闭过夜；一抗室温下振荡孵育 3 小时， TBST 快速洗涤 3 次，振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟；HRP 标记二抗室温下振荡孵育 1h，TBST 快速洗涤 3 次，振荡洗涤 5 次，每次 5 分钟。 1.2.4.3.4 显影 ECL 化学发光法显影，将发光液 A、B 等量混合，使均匀分布于膜上，反应 2min，暗室压片，曝光适量时间，显影，定影。 2 结果 2.1 彗星实验 与对照组相比，氡单独染毒组及亚砷酸钠单独染毒

45、组，各组 HBE 细胞的尾 部 DNA 百分含量、尾距和 Olive 尾距均显著增加（P0.05） ；当联合染毒时，在氡 暴露时间恒定以及亚砷酸钠剂量恒定的条件下，联合染毒组 HBE 细胞尾部 DNA 百分含量、尾距和 Olive 尾距均显著增加，且均高于对照组、氡单独染毒组及亚砷 酸钠单独染毒组（P0.05） 。 2.2 Western blot 实验 与对照组比较，各染毒组的 DNA 损伤蛋白 H2AX 表达量明显增加，而 DNA 修复蛋白 Rad51 表达量下降；与氡单独染毒组和亚砷酸钠单独染毒组相比，联合 染毒组 H2AX 表达量明显增加，Rad51 表达量明显降低，且随着染亚砷酸钠剂

46、量 的增加，H2AX 表达量呈现上升趋势，Rad51 表达量呈现下降趋势 表 3.1 氡浓度为 20 000 Bq/m3不同暴露时间与亚砷酸钠不同剂量联合染毒对 HBE 细胞的 DNA 损伤（x s） 氡 （min） 亚砷酸钠 （mol /L） 尾部 DNA 百分含量（%） 尾距（m） Oliver 尾距（m） 0 0 2.5850.367 0.1100.034 0.3650.032 10 0 9.2611.771a 1.2330.321b 1.9650.403c 20 0 12.1871.991a 2.1730.598b 2.5690.389c 40 0 14.5771.467a 3.062

47、0.537b 3.5630.488c 0 1.5 8.6961.918a 1.1540.541b 1.3950.394c 0 3.0 11.3823.392a 2.2541.216b 2.2130.375c 氡与亚砷酸钠对氡与亚砷酸钠对 HBE 细胞联合毒性作用研究细胞联合毒性作用研究 第第三三部分部分 25 0 6.0 12.3462.033a 2.8560.641b 2.5700.399c 10 1.5 14.8641.982adm 3.4070.708ben 3.4750.372cfo 10 3.0 18.8393.405adp 4.6390.997beq 4.2320.374cfr 1

48、0 6.0 19.9303.586ads 6.4691.561bet 4.8450.327cfu 20 1.5 17.0061.432agm 3.9320.665bhn 4.2400.296cio 20 3.0 21.3412.713agp 5.1811.077bhq 4.9750.310cir 20 6.0 22.0241.585ags 6.2290.777bht 5.6670.350ciu 40 1.5 38.8463.334ajm 47.5359.267bkn 19.2784.481clo 40 3.0 40.3024.102ajp 48.5476.919bkq 23.5715.393c

49、lr 40 6.0 59.60311.430ajs 83.9217.786bkt 43.3455.530clu 注：与空白对照组（0 min+0mol/L）比较，a尾部 DNA 百分含量 P0.05，b尾距 P0.05， c Oliver 尾距 P0.05；与氡单独染毒组（10 min）比较，d尾部 DNA 百分含量 P0.05，e尾距 P0.05，f Oliver 尾距 P0.05；与氡单独染毒组（20 min）比较，g尾部 DNA 百分含量 P0.05， h尾距 P0.05，i Oliver 尾距 P0.05；与氡单独染毒组（40 min）比较，j尾部 DNA 百分含量 P0.05，k尾距 P0.05，l Oliver 尾距 P0.05；与亚砷酸钠单独染毒组（1.5mol/L）比较，m 尾部 DNA 百分含量