[精品论文]一株能与盾叶薯蓣细胞共培养的内生.doc

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1、精品论文http:/一株能与盾叶薯蓣细胞共培养的内生真菌分离及其生物学特性袁丽红陆玉婷许琳欧阳平凯*（南京工业大学制药与生命科学学院 南京 210009）摘要: 从盾叶薯蓣根状茎中分离到一株在离体条件下与盾叶薯蓣愈伤组织协调生长的内生真菌（RE0105）。 该菌在多种培养基上均未见孢子产生。测定了该菌的 ITS1-5.8S rDNA-ITS2 序列并构建了系统发育树，在 系统发育树中内生真菌 RE0105 与 Libertella 属形成一个类群，具有较近亲缘关系。内生真菌 RE0105 能够 产生与宿主植物相同的代谢产物薯蓣皂苷元。对内生真菌 RE0105 培养的生长特性研究表明，富含有机

2、营养的培养基有利于其生长；盾叶薯蓣细胞提取物可明显刺激内生真菌生长；20mol/L 生长素 NAA 和 2,4-D 能够促进内生真菌 RE0105 的生长。200 mol/L 细胞分裂素 KT 和 BA 对 RE0105 生长具有一定的促进作用， 但与生长素相比，细胞分裂素对 RE0105 生长的刺激作用较小。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖和硝酸 铵是内生真菌 RE0105 生长的良好碳源和无机氮源，氯化铵和硫酸铵对内生真菌生长具有明显抑制作用， 并且显著影响内生真菌 RE0105 形态特征。关键词：培养特性；薯蓣皂苷元；离体共培养；ITS1-5.8S rDNA-ITS2 区域；系统发育分析中

3、图分类号：Q939.5文献标识码：A文章编号：植物内生真菌是生活在植物组织和细胞内不引起宿主植物明显感染症状的真菌，普遍存 在于植物体内，从目前已研究过的植物看，未发现没有分离到内生真菌的植物（Arnold et al.,2000）。尽管内生真菌在植物体内的生物量微不足道，但其长期生活在植物体内这一特殊环 境中，并与寄主协同进化，二者间形成了互惠共生关系：一方面内生真菌可以从宿主植物中 吸取营养，并得到保护；另一方内生真菌能够促进宿主植物生长发育,增强宿主植物对生物 胁迫(食草动物、昆虫、病原菌)及非生物胁迫(高温、干旱、高盐等)的抗逆性（黎万奎和胡 之璧，2005)。由于自然条件下内生真菌植

4、物所形成的共生体特征不明显以及内生真菌人 工接种的困难（Latch G C & Christensen, 1985；Johnson et al.,1986; Kearney et al., 1991），绝 大多数内生真菌植物共生关系未被认识和研究。目前有关内生真菌与宿主植物共生关系的 研究主要 是 基于有性 世 代内生真 菌 Epichle (Clavicipitaceae, Ascomycota) 和无性型 Neotyphodium 与两种禾本科植物高羊茅和多年生黑麦草相互作用的研究结果。此外，在研 究内生真菌作用机理实验中，研究者建立的多是实生苗“内生真菌感染植株”和“未感染植株” 实验种

5、群。从生态学角度讲，任何生活在自然环境中植物体均存在内生菌，即使是无菌苗， 进入温室或大田后其它微生物也会定殖于其体内，从而无法判断是内生真菌作用的结果还是 来自于环境中其它生物作用的结果。因此，利用田间或温室建立的内生真菌宿主植物共生 体研究二者作用机理存在一定问题。基于内生真菌在与宿主植物长期生活和协同进化过程中二者间的互惠共生关系，在实验室离体条件下建立内生真菌宿主植物细胞共培养体系可为研究内生真菌在与宿主植物相 互作用机理提供一种可行的研究体系。目前有关离体条件下能与宿主植物细胞共培养的内生 真菌的研究尚未见报道。盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H. Wr

6、ight)为薯蓣科薯蓣属植物，是我国特有的、具基金项目：国家自然科学基金项目（No. 20276030）作者简介：袁丽红（1965），女，教授*通讯作者：欧阳平凯，教授，博士生导师. E-mail: 2精品论文有重要经济意义的药用植物，从其根状茎提取的薯蓣皂苷元(Diosgenin)是合成甾体激素类药物的重要原料。提取的皂苷素也是生产盾叶冠心宁、地奥心血康等治疗心血管疾病药物的重 要原料。目前对盾叶薯蓣内生真菌研究尚少见报道。本研究以盾叶薯蓣为材料，从中分离筛 选到一株能与盾叶细胞共培养的内生真菌，并对其培养生物学特性进行了研究，为在实验室 离体条件下建立内生真菌宿主植物细胞共培养体系以及进一

7、步研究二者相互作用的关系 与机理奠定基础。1 材料与方法1.1 供试植物 从江苏省植物研究所采集的健康的盾叶薯蓣全株。1.2 内生真菌的分离 用洗涤剂将盾叶薯蓣叶、茎和根状茎清洗干净后置于流水下冲洗过夜，于超净工作台上将叶、茎段和根状茎分别用灭菌滤纸洗干水分后，依次用 75乙醇消毒 1 min、0.1升汞消毒 10 min，最后用无菌水漂洗 3 次并用灭菌滤纸吸干水分。将叶片切成 0.50.5 cm 小块、 叶和叶柄切成 0.5 cm 长短小段、根状茎先切成 0.5 cm 厚小片，再纵切 4 块。将上述各组织 块接种于 CMM 培养基（Bacon，1990）上，于 26恒温培养箱中培养，每天观

8、察有无菌丝 长出，待从样品切口处有菌丝长出，转接至新鲜 CMM 培养基上培养，并用菌丝顶端法纯化， 纯化后的菌株于 CMM 培养基上保存。1.3 内生真菌与盾叶薯蓣愈伤组织共培养先将盾叶薯蓣愈伤组织接种于 MS 培养基上（其中附加 NAA 2.0 mg/L, BA 0.2 mg/L, 蔗 糖 30 g/L，pH5.8），再将直径 6 mm 菌块靠近愈伤组织块接种于 MS 培养基中，于 26黑 暗条件下培养并观察愈伤组织和真菌生长情况。1.4 内生真菌菌体特征和菌落特征观察采用三点接种法挑取少量菌丝接种于 PDA 平板培养基上，于 26黑暗条件下培养 21d， 观察菌落和菌体特征。1.5 内生真

9、菌分子鉴定菌丝体总 DNA 提取采用氯化苄法（朱衡等，1994）。选用引物对 ITS4 和 ITS5（White et al.，1990）扩增 ITS1-5.8S-ITS2 区域。PCR 反应体系组成为 5 L 10buffer、1 L dNTP、引 物各 1 L、1 L Taq 酶、3 L 模板、38 L ddH20，反应体系总体积 50 L。PCR 反应条件 为 95 变性 3 min，然后于 94 变性 40 s，52 退火 50 s，72 延伸 1 min，循环 35 次， 最后于 72 延伸 10 min。扩增产物用 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测。用大连宝生物有限公司 胶回收试剂盒回

10、收纯化 PCR 产物，具体步骤按操作手册进行，用 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测 胶回收产物，送交上海英骏生物技术公司测序。以测得的序列作为查询序列，在 GenBank 数据库作 BLAST 比较，从得到的相似序列中选择部分已知分类地位的序列，用 Clustal X 软件进行序列对准，对长短不一的两端进行人工调整。用 MEGA Version4 软件构建 MaximumParsomony 进化树，并进行 bootstrap 验证评价进化树可靠性，设 1000 次重复 (Tamura et al.，2007)。1.6 内生真菌的液体培养及其水解产物提取和分析将生长于 CMM 培养基上的菌丝块 20

11、 块（直径 6mm）接种于 100 mL PD 液体培养基中，26振荡培养 35d，转速 120 r/min，收集菌体再接入 100 mL SM（Bacon，1990）培养基中 继续振荡培养 10d，收获菌体。称取内生真菌培养物 10 g，置于磨口三角瓶内，加入 1.5 mol/L H2SO4-70%异丙醇溶液 30 mL，沸水浴回流提取 8 h，冷却、抽滤，在滤液中加入等体积的 蒸馏水，用等体积的正己烷萃取三次，合并后用 1% NaOH 洗至无色，再用蒸馏水洗至中性，50下减压蒸干，所得物质用无水乙醇洗出、蒸干，用甲醇溶解并定容至 5 mL，进行 HPLC/MS 分析。色谱条件为：Kroma

12、sil C18 反相色谱柱（4.6mm250mm，5），流动相为 纯甲醇，流速 1.0 ml/min，检测波长 208 nm。1.7 盾叶薯蓣内生真菌培养生长特性1.7.1 不同培养基对内生真菌生长影响供试培养基分别为 CMM、M102（Bacon，1990）、PDA、MS、查氏(Czapek)培养基。 将直径 6 mm 菌丝块分别接种于待测培养基的平板培养基上，每皿接 4 块，接 5 皿。于 26 黑暗下培养，每 7d 测量菌落直径。1.7.2 盾叶薯蓣细胞提取物对内生真菌生长影响分别称取 10、20、30、40 g 盾叶薯蓣鲜细胞，研磨、抽滤，将滤液加入到 100 mL 查氏 培养基中。接

13、种、培养及测定方法同 2.7.1。1.7.3 植物生长调节物质对内生真菌生长的影响 供试的生长调节物质分别为生长素（NAA、2,4-D）和细胞分裂素（BA、KT）。以查氏培养基（未加盾叶薯蓣细胞提取物）为基本培养基。供试各激素浓度均选择三个水平：0.2、20、200 mol/L。接种、培养及测定方法同 2.7.11.7.4 不同碳源对内生真菌生长影响 以查氏培养基为基本培养基（其中添加盾叶薯蓣细胞提取物，100 mL 培养基加入 30 g细胞提取物）。供试碳源分别为蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、鼠李糖。在基本培养基中分别加入单一的供试碳源，碳源用量均为 30 g/L。接种、培养及测定

14、方法同 2.7.1。1.7.5 不同氮源对内生真菌生长影响 供试氮源为无机氮源，分别为硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、磷酸氢二铵、硫酸铵、硝酸铵。以查氏培养基为基本培养基，其中添加盾叶薯蓣细胞提取物，加量同 2.7.4。在基本培养基中分别加入单一的供试无机氮源，浓度均为 35 mmol/L。接种、培养及测定方法同 2.7.1。122 结果与分析2.1 能与盾叶薯蓣细胞共培养的内生真菌分离盾叶薯蓣组织块培养 28 周后，从组织块切口处开始有菌丝生长出来。将长出来的菌 丝重新接种到新鲜 CMM 培养基上，并采用菌丝顶端纯化法进行纯化。先后从盾叶薯蓣不同 组织部位分离到 6 株具有不同培养特征的真菌分离物，

15、其中从根状茎分离出 2 株、叶片分离 出 3 株、茎分离出 1 株。分别将分离得到的真菌分离物与盾叶薯蓣愈伤组织共培养。结果发 现，培养 30 天只有分离自根状茎的真菌分离物 RE0105 能与愈伤组织形成协调生长关系， 二者之间具有亲和性（图 1），而其它真菌分离物生长较快，覆盖整个愈伤组织，或被侵染 的愈伤组织在共培养 520 天后褐化而逐渐死亡。因此，从真菌与宿主间亲和性的角度，认 为真菌分离物 RE0105 是一株能够与宿主细胞协调生长或具有互惠共生关系的内生真菌。图 1 内生真菌 RE0105 与盾叶薯蓣愈伤组织共培养Fig. 1. In vitro co-cultivation o

16、f endophytic fungus RE0105 and D. zingiberensis calli2.2 内生真菌 RE0105 形态特征在 PDA 培养基上内生真菌 RE0105 生长非常缓慢，菌落隆起、致密、不规则，正面灰 色，背面黑色（图 2）。形成气生菌丝和基内菌丝，气生菌丝绒毛短。培养 21 天的菌体在显 微镜下观察，基内菌丝较粗、分枝少、有隔膜，气生菌丝较粗、具分枝，隔膜少，未见孢子 产生（图 3）。在 MEA、CMM、M102、查氏等培养基上培养也均未产生孢子。图 2 在 PDA 培养基上培养 21 天的内生真菌 RE0105 菌落特征Fig.2 21-day-old c

17、ultures of endophytic fungus RE0105 grown on PDA medium图 3 内生真菌 RE0105 菌体特征a. 基内菌丝b. 气生菌丝Fig.3 Microscopic view of endophytic fungus RE0105 a. substrate hyphab. aerial hypha2.3 内生真菌 RE0105 分子鉴定利用 ITS4 和 ITS5 引物对扩增出一段长度为 576 bp 的 DNA 序列（Genbank accessionDQ778612），其序列特征为 144 bp 为 18S rDNA 部分序列，45218 b

18、p 为 ITS1 序列，219373 bp 为 5.8S rDNA 序列，374517 bp 为 ITS2 序列，518576 bp 为 28S rDNA 部分序列。 将 ITS1-5.8S rDNA-ITS2 区域的序列在 GenBank 中进行 BLAST 比较，并从相似序列中选出 Libertella sp.等 19 株分类地位已知的真菌构建系统发育树。图 4 显示内生真菌 RE0105 与 Libertella sp.形成一个类群，支持强度为 82%, 说明内生真菌 RE0105 与 Libertella sp.真菌具有较近亲缘关系。47929786439938826041426810

19、099709897Pleopsidium flavum (DQ525521) Pleopsidium gobiense (DQ525494) Pleopsidium chlorophanum (DQ525524) Acarospora peliscypha (DQ374132) Acarospora sp. Nimis 4255 (DQ525528) Sarea sp. BC16 (DQ317349)Helotiales sp. Bjelland 61 (AY011014) Botryosphaeria eucalypticola (DQ131571) Libertella sp. EXP05

20、57F (DQ914681) RE0105Coniosporium apollinis (AJ244271) Helicosporium guianense (AY916487)Tubeufia cerea (Helicosporium vegetum) (AY916488) Cryomyces promontorium (DQ028270)Buellia sp. KoLRI Udo-13 (AY762037) Biatora helvola (AJ247557)Biatora pseudohelvola (AJ247571) Biatora meiocarpa (AM292667) Biat

21、ora subduple (AJ247540) Peltaster sp. P6 (AY598891)图 4 基于 ITS1-5.8S rDNA-ITS2 序列的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS1-5.8S rDNA-ITS2 sequence of fungus RE0105 and 19 reference strains(Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank)2.4 内生真菌 RE0105 发酵产物分析采用两步培养法，首先将内生

22、真菌 RE0105 在 PD 液体培养基中培养 35d，在转入 SM培养基中培养 10d，对其发酵产物进行 HPLC/MS 分析，结果见图 5。可见，内生真菌 RE0105 发酵产物出现了薯蓣皂苷元（Diosgenin）的波峰（图 5a）。薯蓣皂苷元分子量为 414，图 5b 中 m/z 415.4 为分子离子锋M+H+，说明内生直接 RE0105 能够产生薯蓣皂苷元。图 5 内生真菌 RE0105 合成产物的高效液相图谱(a)和合成的薯蓣皂苷元的电喷雾质谱图(b)Fig. 5. HPLC(a) and Electrospray mass spectrum(b) of diosgenin sy

23、nthesized by fungus RE01052.5 内生真菌 RE0105 培养生物学特性2.5.1 不同培养基对内生真菌 RE0105 生长的影响32 M1 0 2CMM 28 PDA MS colony diameter / mm24 Cz a p e k20 16 12 840 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in cu ba tion tim e /d图 6 不同培养基对内生真菌 RE0105 生长的影响Fig.6 Effects of media on the growth of endophytic fungus RE0105图 6 结果表明，内生真菌 RE0105

24、在 M102、CMM、PDA、MS 和 Czapek 等 5 种不同 培养基上的生长速度具明显差异。在 CMM 培养基上生长最佳，其次是 M102，再次是 PDA； 在查氏培养基上未见明显生长；在植物细胞培养的常用培养基 MS 上也表现出一定的生长。 可见，内生真菌的活体依赖性决定其离体培养时对有机营养物质的需要，培养基中有机物质 越丰富，越有利于内生真菌生长。2.5.2 盾叶薯蓣细胞提取物和植物生长调节物质对内生真菌 RE0105 生长的影响内生真菌生活在植物体内，二者在长期共同生活中形成了密切的关系，宿主植物为内生 真菌提供养分。为此，研究了盾叶薯蓣细胞提取物和植物生长调节物质对内生真菌

25、RE0105生长的影响。colony diameter / mm24 C z ap ek 22 C z ap ek+ 1 0g 20C z ap ek+ 2 0g C z ap ek+ 3 0g 18 C z ap ek+ 4 0g 16 14 12 10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in c u b a tio n tim e /d图 7 盾叶薯蓣细胞提取物对内生真菌 RE0105 生长的影响Fig.7 Effects of cell extracts on the growth of endophytic fungus RE0105图 7 结果表明，盾叶薯蓣细胞提取物能

26、明显刺激内生真菌 RE0105 生长，并且细胞提取 物的添加量对 RE0105 生长的影响具有一定差异。在 100 mL 查氏培养基中加入 30 g 盾叶薯 蓣鲜细胞提取物时内生真菌 RE0105 生长最快，但是当细胞提取物加入量过高时内生真菌生 长速率有所下降。实验进一步对盾叶薯蓣细胞提取物对内生真菌 RE0105 生长影响进行了研究。一是在100mL 蒸馏水中只加细胞提取物，而不加碳氮源等其它营养物质；二是在 MS 固体培养基（其中蔗糖浓度为 30 g/L）中同时接种盾叶薯蓣愈伤组织（细胞接种量为 1.5 g/瓶，100 mL 三角瓶分装 30mL 培养基）。结果发现（图 8）内生真菌 R

27、E0105 也表现出较高生长速率。这 一结果说明虽然盾叶薯蓣细胞提取物中含有可供内生真菌 RE0105 生长的碳源、氮源等营养 物质，但细胞提取物对内生真菌生长的刺激作用并不是由于提取物添加而增加营养物质浓度 的结果，而是细胞提取物为内生真菌提供某种或某些生长因子，但有关生长因子的本质有待 进一步研究。20 30g ce ll e xtracts18 MS + live c a llicolony diameter / mm16 14 12 10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in c u ba tion tim e / d图 8 盾叶薯蓣细胞和细胞提取物对内生真菌 RE01

28、05 生长的影响Fig.8 Effects of D. zingiberensis cells and cell extracts on the growth of endophytic fungus RE010516 2,4-D 0.2 mo l/L2,4-D 20 mo l/L14 2,4-D 200 mo l/L N A A 0.2 mo l/LN AA 2 0 mo l/Lcolony diameter / mm12 N AA 2 0 0 mo l/L10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0inc u bation tim e /d图 9 生长素及其浓度对内生真菌 RE0

29、105 生长的影响Fig.9 Effects of auxins and their concentrartions on the growth of endophytic fungus RE0105图 9 显示生长素 NAA 和 2,4-D 对内生真菌 RE0105 生长的影响。在培养基中加入适宜 浓度（20 mol/L）生长素能够促进内生真菌的生长，但生长素浓度过高 (200 mol/L）时 对内生真菌生长刺激作用较小。NAA 对内生真菌 RE0105 的刺激作用大于 2,4-D。图 10 显示细胞分裂素 BA 和 KT 对内生真菌 RE0105 生长的影响。与生长素相比，细胞 分裂素对内

30、生真菌 RE0105 生长的促进作用较小，只有在高浓度（200 mol/L）下才有一定的效果，同时也发现 KT 刺激作用略大于 BA。14 BA 0 .2 mo l/L BA 2 0 mo l/L12 BA 2 0 0 mo l/LKT 0 .2 mo l/L KT 2 0 mo l/L10 KT 2 0 0 mo l/L8colony diameter / mm640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in c u b a tio n tim e /d图 10 细胞分裂素及其浓度对内生真菌 RE0105 生长的影响Fig.10 Effects of cytokinins and thei

31、r concentrartions on the growth of endophytic fungus RE01052.5.3 碳源对内生真菌 RE0105 生长的影响22 20Rh a m n o s eXylo s e18La ctos eGa la c to s ecolony diameter16 Fru c to s e14G luc os eSu c ro s e12 10 86401 02 03 04 05 0in c u b a tio n tim e / d图 11 碳源对内生真菌 RE0105 生长的影响Fig.11 Effects of carbon sources o

32、n the growth of endophytic fungus RE0105图 11 结果显示内生真菌 RE0105 可以利用多种简单碳源，但是对不同碳源利用能力表现出一定差异。蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖是内生真菌 RE0105 生长的良好碳源；木糖也是 其生长的较好碳源，内生真菌 RE0105 具有降解和利用 5C 糖的能力；在含有半乳糖培养基 上内生真菌生长略差；内生真菌 RE0105 不能利用氨基糖鼠李糖。2.5.4 无机氮源对内生真菌 RE0105 生长的影响图 12 显示无机氮源对内生真菌 RE0105 生长的影响。在培养前期（21d 前）无机氮源种 类对 RE0105 生长的影响

33、差异不大，但 21d 后对 RE0105 生长的影响表现出明显不同。既为 氨态氮又为硝态氮的硝酸铵更有利于内生真菌生长；其次为硝酸钠和磷酸氢二铵，说明单独 以氨态氮或硝态氮为氮源对 RE0105 生长影响差异不大；但氯化铵和硫酸铵为氮源不利于 RE0105 生长，即使在培养基中添加薯蓣细胞提取物，RE0105 生长也受到明显抑制。此外， 实验还发现内生真菌 RE0105 在以氯化铵或硫酸铵为氮源的培养基上培养约 80 天时，在其 菌落表面形成一些白色结构（图 13a），镜检发现是大量圆形囊状结构聚集体（图 13b），该 结构是否为其繁殖方式有待进一步研究。同时 RE0105 菌丝结构也发生明显

34、变化，在菌丝顶 端或中间形成大量的膨大细胞（图 13c）。322 Na NO 20 KN O 3colony diameter / mm18NH 4Cl (NH 4)2HP O 44 2416 (NH ) SO 14 NH 4NO 312 10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in cu bation tim e /d图 12 无机氮源对内生真菌 RE0105 生长的影响Fig.12 Effects of inorganic nitrogen sources on the growth of endophytic fungus RE0105图 13 内生真菌 RE0105 在

35、NH4Cl 为氮源的 Czapek 培养基上的形态特征a 形成的白色结构; b 白色结构的显微观察; c 菌丝上形成的膨大细胞Fig.13 Morphological characteristics of fungus RE0105 grown on Czapek mediuma. Some white agglomerates on the surface of the colony after about 80 days of incubation. b. Microscopic view of white agglomerates. c. Apical and intercalary s

36、wollen cells formed in hypha3 讨论本研究从盾叶薯蓣根状茎、茎和叶中共分离出 6 株具有不同培养特征的内生真菌。与盾 叶薯蓣愈伤组织共培养，发现只有分离自根状茎的真菌分离物 RE0105 能与盾叶薯蓣愈伤组 织形成协调生长关系。这说明生活在植物体内的真菌与宿主植物间的关系较为复杂，一些可 能为互惠共生关系，一些可能为偏利共生关系。对内生真菌 RE0105 菌体特征研究发现该内生真菌在多种培养基上均不能产生孢子，这 一结果与许多文献对内生真菌的研究报道相似。例如，Guo et al.(2000)从棕榈中分离到 778 株真菌分离物，其中 128 株（约占 16.5）不

37、产孢子。Fisher et al. (1994)从瑞士 Quercusilex 的枝条中分离到的内生真菌高达 54为无孢菌群，叶片中有 18分离物不产孢子。可见， 不产孢或较难产孢是内生真菌的一个普遍特征，这可能是由于内生真菌在与宿主植物长期共 生生长中逐步丧失了产孢能力。虽然富含有机营养的培养基有利于内生真菌 RE0105 生长， 但与多数真菌相比，内生真菌 RE0105 生长缓慢，在 CMM 和 PDA 上培养 50 天菌落直径净 增长分别为 23.6mm 和 12.5mm。Moon et al. (2002)报道分离自禾草的内生真菌 Neotyphodium aotearoae, N.

38、australiense 和 N. melicicola 生长速度缓慢，在 PDA 培养基上培养 5 周，菌落大 小分别为 411mm、1319mm 和 1019mm。产生紫杉醇的内生真菌 Taxomyces andreanae 和 Periconia sp.培养周期也较长，达 21 天 (Stierle et al. 1993, Li et al. 1998)。可见，生长缓慢 可能也是内生真菌的一个普遍特征。经典的真菌分类鉴定以形态结构为主要依据，包括有性繁殖和无性繁殖结构特征、有性 孢子和无性孢子形状、颜色和大小、菌丝或细胞结构等。研究表明，在已研究的内生真菌中 有相当一部分内生真菌不产孢

39、或难于产孢。因此，利用经典分类方法鉴定内生真菌具有一定 困难。随着 DNA 序列分析技术的日益成熟，rDNA 及其转录间区（ITS）的序列分析愈来愈 多被用于真菌分类鉴定和分子系统学研究中。鉴于内生真菌 RE0105 在多种培养基上培养不 产孢，本研究对其 ITS1-5.8SITS2 区域的碱基序列进行了测定并选择 Libertella sp 等 19 株 参考菌株进行了系统发育分析，发现内生真菌 RE0105 与 Libertella sp 具有较近亲缘关系， 二者碱基相似性为 76.1，但是否为 Libertella 属尚有待进一步确证。Libertella（盘针孢菌 属）是引起杨树腐烂和

40、油杉枝锈病的病原菌。若内生真菌 RE0105 为 Libertella 属真菌，则 说明 Libertella 与不同宿主植物之间表现出不同关系，在一种宿主上可能为共生关系，而在 另一种宿主上为寄生关系。通过对内生真菌 RE0105 液体发酵培养和合成产物的 HPLS/MS 分析，首次发现分离自 盾叶薯蓣根状茎的内生真菌能够产生薯蓣皂苷元，再一次为内生真菌能够产与宿主植物相同 或相似代谢产物提供了实验证据。同时这一结果也为今后用微生物发酵法生产薯蓣皂苷元提 供了一条新途径，具有实际应用意义。本文从内生真菌 RE0105 利用多种营养的情况可以看出，RE1005 可利用的碳源较为广 泛，无机氮源

41、中既为氨态氮又为硝态氮的硝酸铵较有利于 RE0105 生长。但由于自然条件下 内生真菌所处的特殊的生长环境，内生真菌对活体的依赖性决定了其对有机营养物质的需要。研究发现富含有机营养的培养基和盾叶薯蓣细胞提取物对内生真菌生长具有明显刺激作用，但细胞提取物对内生真菌生长刺激作用是否具有特异性，即其它种类植物细胞提取物对 该内生真菌生长是否具有刺激作用以及刺激效果如何尚有待进一步研究。同时还首次发现适 宜浓度（20mol/L）生长素（NAA、2，4D）能明显促进 RE0105 生长。上述结果为今 后进一步研究内生真菌和内生真菌与宿主植物相互作用的关系奠定了基础。References1. Arnold

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