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1、精品论文推荐玉米自交系成熟胚再生体系的建立王延鹏 甘肃农业大学农学院，兰州（730070） E-mail：摘要：试验选取优良玉米自交系 K12、昌 7-2、137、87-1、478、郑 58、综 3、178 的成 熟胚作为外植体，以 MS 为基本培养基，通过调节培养基中 2，4-D 浓度和 BAP 浓度，观察玉米成熟胚愈伤组织的诱导情况，对影响玉米成熟胚愈伤组织的若干因素进行研究，以建立 较好的再生体系，为下一步的遗传工程操作奠定基础。实验结果表明，玉米愈伤组织的诱导因基因型的不同有明显的差异，K12 诱导率最高达 95%，而郑 58、综 3、178、137 诱导率 均为 0。因此，基因型是影
2、响玉米愈伤组织诱导和培养的一个重要因素。当 2，4-D 和 BAP浓度分别为 6mg/L 和 0.001mg/L 时成熟胚愈伤组织诱导率最高达 95%，由此可见，玉米成 熟胚愈伤组织的诱导率受 2，4-D 和 BAP 的影响较大。关键词：玉米；成熟胚；愈伤组织玉米是世界第三大粮食作物，种植面积仅次于水稻和小麦，是主要的粮食和饲料作物， 也是制药淀粉糖精和酒精工业的重要原料，在国民生产中占有重要地位。随着全世界人 口的增长以及畜牧业和工业的发展，发展玉米产业具有十分重要的意义。然而，随着栽培条件的改善，种植密度的增加，大斑病、丝黑穗病等玉米病害成为我国 春玉米产区的主要病害，而小斑病等成为夏玉米
3、产区的主要病害，严重影响我国玉米生产的 产量和品质。为了生产发展的需要，高产、优质、多抗性是玉米育种工作的基本要求。采用 常规育种周期长，耗时费力，远远不能满足生产发展的需要，更重要的是由于少数自交系长 时间大面积的使用导致了玉米抗性资源的极度匮乏，极大的限制了传统方法在玉米抗病育 种中的成效。近年来，遗传转化技术在玉米育种中取得一定的成果，为玉米育种工作创造了 一条新的途径。然而，建立良好的受体系统是玉米遗传转化的一个重要前提，关系到提供适宜转化的受 体材料以及转化后的细胞能否再生为正常植株等问题。自1975年，Green和Philips以A188的幼胚为材料，诱导出二倍体愈伤组织，并首次获
4、得 玉米再生植株以来，至今，人们已经能从多种外植体中诱导出愈伤组织，例如花药，雌雄幼 穗，雄幼穗的颖片，未成熟花序，幼苗的芽顶分生组织，幼苗基部叶片,幼苗切段，节间芽 组织，有的不但能诱导出愈伤组织，而且还成功地获得了再生植株，但以幼胚作为外植体最 佳，也是目前应用最多的外植体1，12(Lu等1982,1983;Vasil等1984;Amstrong等1985)13，14。然 而，玉米幼胚作为外植体，取材受到地理条件、季节和发育阶段的严格限制。相比之下，成 熟胚取材方便，不受时间和数量的限制，是一种较理想的适合于玉米遗传转化的再生体系。 在禾谷类作物中，水稻(Rueb等1994)，小麦(Ozg
5、en等1998)，大麦(Akula等1999)，燕麦(Ward KA和Jordan 2001)等都有利用成熟胚作为外植体获得再生植株的成功报道。在玉米中，Green 等(1974)首次报道利用成熟胚可以诱导愈伤组织，但没有再生植株。Wang(1987)从两个玉米 自交系B73和Mo17的成熟胚中诱导愈伤组织并再生植株，但再生是基因型依赖的，再生频率 仅4%-5%。本研究中我拟将选取8个国内大面积种植的优良玉米自交系，对影响玉米成熟胚 愈伤组织诱导、继代及分化的若干因素进行研究，以建立较好的再生体系，为下一步的遗传 工程操作奠定基础。- 7 -1. 材料与方法1.1 实验材料本实验所用材料为由甘
6、肃农业大学育种组玉米课题组提供的玉米骨干自交系 K12、昌7-2、137、87-1、478、郑 58、综 3、178 的成熟种子。1.2 实验设计及方法1.2.1 实验仪器 烘箱、冰箱、超净工作台、蒸馏水器、温度计、酸度计、药物天平、分析天平、高压锅、可调试电炉、剪刀、酒精灯、漏斗、试管、锥形瓶、三角瓶、量筒、容量瓶、移液管、橡皮筋等。1.2.2 培养基配方的设计为研究 2，4-D 和 BAP 对玉米愈伤组织诱导的影响，实验共设计 5 组培养基，以 MS 固 体培养基为基本培养基。各组培养基配方如下：A1: MS+60%麦芽糖+ 0 mg/L2,4-D+ 0mg/LBAPA2: MS+60%麦
7、芽糖+ 0 mg/L2,4-D+ 0.001mg/LBAP A3: MS+60%麦芽糖+ 0 mg/L2,4-D+ 0.1mg/LBAP A4: MS+60%麦芽糖+ 0 mg/L2,4-D+ 2mg/LBAPA5: MS+60%麦芽糖+ 0 mg/L2,4-D+ 3mg/LBAP B1: MS+60%麦芽糖+ 3 mg/L2,4-D+ 0mg/LBAPB2: MS+60%麦芽糖+3 mg/L2,4-D+ 0.001mg/LBAP B3: MS+60%麦芽糖+3 mg/L2,4-D+ 0.1mg/LBAP B4: MS+60%麦芽糖+3 mg/L2,4-D+ 2mg/LBAPB5: MS+60
8、%麦芽糖+ 3 mg/L2,4-D+ 3mg/LBAP C1: MS+60%麦芽糖+ 4 mg/L2,4-D+ 0mg/LBAPC2: MS+60%麦芽糖+ 4mg/L2,4-D+ 0.001mg/LBAP C3: MS+60%麦芽糖+ 4 mg/L2,4-D+ 0.1mg/LBAP C4: MS+60%麦芽糖+ 4 mg/L2,4-D+ 2mg/LBAPC5: MS+60%麦芽糖+ 4 mg/L2,4-D+ 3mg/LBAP D1: MS+60%麦芽糖+ 6 mg/L2,4-D+ 0mg/LBAPD2: MS+60%麦芽糖+ 6mg/L2,4-D+ 0.001mg/LBAP D3: MS+6
9、0%麦芽糖+ 6 mg/L2,4-D+ 0.1mg/LBAP D4: MS+60%麦芽糖+ 6 mg/L2,4-D+ 2mg/LBAPD5: MS+60%麦芽糖+ 6 mg/L2,4-D+ 3mg/LBAP E1: MS+60%麦芽糖+ 10 mg/L2,4-D+ 0mg/LBAPE2: MS+60%麦芽糖+ 10mg/L2,4-D+ 0.001mg/LBAP E3: MS+60%麦芽糖+ 10 mg/L2,4-D+ 0.1mg/LBAP E4: MS+60%麦芽糖+ 10 mg/L2,4-D+ 2mg/LBAPE5: MS+60%麦芽糖+ 10 mg/L2,4-D+ 3mg/LBAP在实验前
10、先配制好实验中所用到的培养基母液和各种氨基酸和激素，再配制实验所用的15 种培养基。除了激素以外，所有的培养基的其他成分混合在一起，调节 PH 值到 5.8，加入 0.7%的琼脂后加蒸馏水到 1L 然后加热到琼脂溶解，分装在灭菌过的 100ml 三角瓶中密封 后放入高压灭菌锅在 121下灭菌 20 分钟后取出备用。1.3 方法：1.3.1 外植体的灭菌 挑选大而饱满的成熟的玉米种子置于三角瓶中，采用两步消毒法，即先在超净工作台下添加 75%的乙醇溶液淹没玉米种子，浸泡 45 分钟后清出乙醇溶液，再加入 0.1%升汞溶液将种子浸泡 1012 分钟，清出升汞溶液，然后用无菌水冲洗 45 次，最后将
11、种子装入三角 瓶中，用无菌水在 4浸泡 48 小时。1.3.2 初级愈伤组织的诱导将浸泡好的玉米自交系 K12 种子置于灭菌好的超净工作台下，用解剖刀剥取成熟胚， 将其盾片朝上接种于经高压灭菌准备好的添加了 MS 培养基和激素的培养皿中，每皿 12 粒， 每处理接 6 个重复。接种完密封处理，放置在 26暗培养箱中进行暗培养。暗培养 35 天时胚芽和胚根伸长，57 天时可以观察到初级愈伤组织的生成。一周后 彻底除去伸长的原始胚芽和胚根，将剩余部分继续培养在同样的培养基上。23 周后除去 盾片留下愈伤组织，并将其接到同样的培养基上继续培养；4-5 周后统计愈伤组织，并将尚 未诱导出愈伤组织的成熟
12、胚继续培养。初步筛选出诱导率最高的培养基,作为愈伤组织的继 代培养基及其他几个自交系的诱导培养基。1.3.3 胚性愈伤组织的诱导4-5 周后，为了研究 2，4-D 浓度对胚性愈伤的影响，将初级愈伤组织转接到继代培养 基（：MS+60%麦芽糖+3 mg/L 2,4-D；：MS+60%麦芽糖+4 mg/L 2，4-D；：MS+60% 麦芽糖+6mg/L 2,4-D；：MS+60%麦芽糖+10 mg/L 2,4-D）上进行继代、筛选和改良。每 次继代时，注意挑选生活力强、生长旺盛、颜色鲜艳、颗粒状特征明显的愈伤组织，每 2 周继代一次以增殖愈伤组织。1.3.4 不同基因型玉米自交系成熟胚愈伤组织的诱
13、导以 K12 作为供试材料进行培养基筛选时，培养基 6M6D1B（MS+60%麦芽糖+6mg/L2,4-D+ 0.001BAP）愈伤组织的诱导率最高。因此，在以后的实验中，以 6M6D1B 作为基本培养 基对其他的 7 个玉米自交系的成熟胚在同样的条件下用同样的方法进行愈伤组织的诱导培 养，并分别在 4 周和 8 周的时候统计初级愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导率。2 结果与分析2. 1 基因型对成熟胚初级愈伤组织诱导的影响基因型是影响愈伤组织诱导诸因素中的一个重要因素4,5,7。基因型不同，分化长成植株 的难易程度也不同。由表 1 中的数据可以看出，在相同的诱导培养上，各种基因型成熟胚愈 伤组织
14、的诱导率差异较大，在 8 个自交系中 K12 诱导率最高，达 90（图 1A）；478、昌 72、871 等几个自交系虽诱导出愈伤组织，但在培养过程中容易出现褐化、水渍化现象 而被淘汰掉；其余的 4 个自交系郑 58、综 3、178、137 愈伤组织的诱导率为 0，在持续的培养中仅发生膨胀，不断继代使成熟胚褐化，没有任何诱导出愈伤组织的迹象（图 1B）。由此可见，成熟胚愈伤组织诱导是基因型依赖的。在对玉米不同基因型的成熟胚进行离体培养的 过程中，诱导率因基因型的不同有明显差异。所以在以后的实验中，不同基因型应该选取不 同的培养基进行愈伤组织的诱导。AB图 1 版图说明 A 在 2，4-D 浓度
15、为 6mg/L、麦芽糖浓度为 60%,即采用 6M6D 培养基时 K12 成熟胚诱导 4周后愈伤组织的情况，B 其他 6 个品种成熟胚诱导 4 周后愈伤组织的情况。表 1 8 个玉米自交系成熟胚在 6M6D（MS+60%麦芽糖+6mg/L2,4-D）培养基中的愈伤组织诱导率自交系外植体数初级愈伤诱导率（4 周后统 计）胚性愈伤诱导率（8 周后统计）K128475（90）24（28）8718450郑 588400综 384001788400137840047884 10（12）5（7） 昌 72847（9）02. 22,4-D 浓度对玉米成熟胚初级愈伤组织诱导的影响同其他单子叶植物一样，在生长调
16、节物质中，2，4-D 是玉米中起主导作用的植物生长 调节物质，是影响愈伤组织诱导和组织分化的关键因素，在组织培养中一般用其作为培养基 中的生长激素。由图表 1 可以看出，在本次实验中，当麦芽糖浓度为 60%时，同样是 2，4-D 浓度为 6mg/L 时玉米愈伤组织诱导率达到了最高值 95%，当 2，4-D 浓度增加到 10mg/L 时 玉米愈伤组织诱导率下降到 70%；由此可见，麦芽糖浓度为定值时，2，4-D 浓度为 6mg/L 对玉米成熟胚愈伤组织的诱导是比较适宜的，2，4-D 浓度太小或过大都会影响玉米愈伤组 织的生长，反而引起愈伤诱导率下降，这和马莲菊4等的报道也比较吻合。10090初级
17、愈伤诱导率(%)807060504030201000346102,4-D浓度(mg/L)图 2 不同浓度 2，4-D 对玉米自交系 K12 成熟胚愈伤组织诱导的影响（每个处理以 84 个成熟胚在 6M6D 作为外植体）2.3 BAP 浓度对玉米成熟胚初级愈伤组织诱导的影响对玉米成熟胚初级愈伤组织诱导时，在生长调节物质中，除 2，4-D 是起主导作用的植 物生长调节物质外，低浓度 BAP 也是影响愈伤组织诱导和组织分化的关键因素，在组织培 养中一般也用 BAP 作为培养基中的生长激素。由图表 2 可以看出，在本次实验中，当 2，4-D 为 6mg/L 时，BAP 浓度为 0.001mg/L 时玉
18、米愈伤组织诱导率达到了最高值 80%，当 BAP 浓度增加到 0.1mg/L 时玉米愈伤组织诱导率下降到 64%；当 BAP 浓度增加到 2mg/L 时玉米 愈伤组织诱导率下降到 33%; 当 BAP 浓度增加到 3mg/L 时玉米愈伤组织诱导率下降到 17%。 由此可见，2，4-D 浓度为定值 6mg/L 时，BAP 浓度为 0.001mg/L 对玉米成熟胚愈伤组织的 诱导是比较适宜的，BAP 浓度为 0mg/L 或过大都会影响玉米愈伤组织的诱导，反而引起愈 伤诱导率下降，这和 Vijendra K.（2005）等的报道一致。9080初级愈伤组织诱导率(%)7060504030201000
19、0.001 0.1 2 3BAP 浓度(mg/L)图 3 不同浓度 BAP 对玉米自交系 K12 成熟胚愈伤组织诱导的影响（每个处理以 84 个成熟胚在 6M6D 作为外植体）2.42，4-D 浓度对 k12 成熟胚胚性愈伤组织诱导的影响在继代培养中，当 2，4-D 浓度较低时，愈伤组织诱导率较高、生长旺盛，且可以长期 保持胚性；但当 2，4-D 浓度过高时，愈伤组织会受到伤害，同时也可以增加无性系变异。 在诱导胚性愈伤组织时，仍以麦芽糖浓度为 60%的 MS 为基本培养基，通过调整 2，4-D 浓 度筛选诱导胚性愈伤组织的最佳培养基。由表 3 可以看出，当 2，4-D 浓度为 3mg/L 时
20、胚性 愈伤组织的诱导率为 39%；随 2，4-D 浓度的增加，胚性愈伤组织的诱导率逐渐下降，当 2，4-D 浓度为 10mg/L 时，胚性愈伤组织诱导率为零。由此可见，在玉米愈伤组织的诱导过程 中，低浓度的 2，4-D 更有利于玉米胚性愈伤组织的诱导。表 2 不同 2，4-D 浓度对 K12 胚性愈伤组织诱导率的影响2，4-D 浓度(mg/L)外植体数（个）胚性愈伤组织诱导率056035622（39%）45615（27%）65618（33%）105603. 讨论组织培养是筛选无性系变异、进行转基因研究的基础，自 70 年代以来对植物基因转化 系统进行了大量的研究，先后建立了许多高效的受体系统，
21、适用于不同转化方法的要求和目 的，为玉米育种工作创造了一条新的途径。曹俊梅等（2005）研究表明，在任何时间都可以 利用成熟胚的培养及愈伤组织再分化进行大量初选，选择愈伤分化率高的基因型，在玉米生 长季节再利用其幼胚进行培养再生和转化研究，从而提高转化的目的性和效率6,12。本实验 在此基础之上，采用不同的培养基以 8 个玉米自交系的成熟胚作为外植体对其愈伤诱导做了 相关的研究，并进行了筛选和探讨。影响玉米成熟胚愈伤组织诱导的因素包括内部因素和外部因素。在内部因素中，关于基 因型对玉米组织培养的影响已经有不少的报道，但结论并不一致。有些学者认为基因型影响 不大或没有发现基因型之间的差异，认为在
22、组织培养中通过改变培养基的成分和激素水平， 能够克服基因型之间的差异。多数研究强调基因型是一个重要因素，不同基因型的愈伤组织 诱导率和愈伤质量差异明显。在本实验中，对 8 个自交系的成熟胚愈伤组织的诱导情况表明， 在对玉米不同基因型的成熟胚进行离体培养的过程中，诱导率因基因型的不同有明显差异， 基因型是决定愈伤组织诱导的主导因素，玉米成熟胚愈伤组织诱导是基因型依赖的。在外部因素中，培养基的成分是影响诱导率的主要因素之一2,7,9，不同培养基的诱导能 力和继代能力有很大的差异，尤其是植物生长调节物质的种类和浓度。在禾谷类作物组织培 养和体细胞胚性诱导过程中，2，4-D 的应用十分普遍，主要起脱分
23、化的作用1,3。本研究结 果表明，在玉米成熟胚培养过程中，添加 2，4-D 是进行愈伤组织诱导的关键因子，适宜的2，4-D 浓度对玉米成熟胚愈伤组织的诱导是必不可少的，但如果 2，4-D 浓度过高又会使玉 米成熟胚愈伤组织诱导率下降。这与前人研究结果相一致5。低浓度的 BAP 对成熟胚愈伤组织的诱导有一定的促进作用。本实验将 BAP 对愈伤组织 诱导的影响也作了相应的研究，结果表明，不同 BAP 浓度对愈伤组织诱导的影响不同，当 BAP 浓度为 0.001 时，愈伤组织的诱导率高达 80%。这一结果和 Vijendra K.(2005) 15等的结果一致。玉米的组织培养是一个复杂的问题，许多年
24、来的研究已经在一些关键的问题上取得了突 破性的成果和一致的结论，但是由于玉米组织培养过程当中的影响因子多，遗传背景复杂， 因此，对于多种因素中各因素的影响和他们之间的相关性还有待于进一步深入的研究。参考文献1王汉宁,张金文等.玉米幼胚愈伤组织诱导及再生J.玉米科学,2006,14(5):71-73. 2何遐义,张秀文,石和平,等.玉米幼胚培养及其影响因素的研究J.中山大学学报论从,1996,2:19-25 3崔广荣,刘正等.对玉米离体培养再生体系的建立J.西北植物学报,2005,25(12):2413-24194 马莲菊，高 峰等 . 玉 米 自 交系幼 胚离 体培 养及 植株 再生研 究 J
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27、he involvement of L-prolineJ.Planta,1985,164:207-21414DUNCAN D R,WILLIAM M E,ZEHR B E,et al.The production of callus capable of plant regeneration from immature embryos of numerous Zeamays gentypesJ.Planta,165:322-33215Vijendra K. Sharma, Robert Hansch, Ralf R. Mendel* and Jutta Schulze（2005）Mature
28、embryo axis-basedhigh frequency somatic embryogenesis and plant regeneration from multiple cultivars of barley (Hordeum vulgare L.) . Journal of Experimental Botany 56: 19131922Callus Initiation from Mature Embryo in Maize Inbreed linesWang yampengGansu Agricultural University，Lanzhou（730070）Abstrac
29、tMature dry seeds of eight maize elite inbred lines (K12、478、chang7-2、87-1、zheng58、137、zong3、178、) were used as source of mature embryos (MEs). In order to set up an efficient maize regeneration system ，based on the MS medium ，the author studied the factor that influenced the induction of MEscallus
30、by changing the concentration of maltose and 2，4-DThe result of study indicated that theinduction of MEs callus were different from eacher other because of different genotypeThe induction ofK12 was highest ，and reached to 95% ，While the induction of genotype zheng58、zong3、178、 and 137 was zeroTheref
31、ore ，Genotype was an important factor that influenced the induction and culture of MEs callusThe concentration of maltose and 2，4-D was another factor that influenced the induction and culture of MEs callusWhen the concentration of maltose and 2，4-D was 60% and 6mg/L，the induction of MEs callus was height and reached to 95%Keywords：maize；mature embryo；callus