CD105特异性SHRNA表达质粒的构建和筛选.pdf

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1、国际眼科杂志2 0 0 8 年6 月第8 卷第6 期 w w w U O c n 电话：0 2 9 - 8 2 2 4 5 1 7 28 3 0 8 5 6 2 8电子信箱：U O 2 0 0 0 1 6 3 c o m C D l0 5 特异性s h R N A 表达质粒的构建和筛选 屈超义，唐罗生，曾杰西，陈百华，罗静，魏为，王文军 实验论著 基金项目：中国高等学校博士学科点专项科研基金( N o 2 0 0 6 0 5 3 3 0 2 6 ) 和中国湖南省科技厅计划项目( N o 0 5 F J 3 0 5 7 ) 作者单位：( 4 1 0 0 1 1 ) 中同湖南省长沙市，巾南大学湘雅

2、二医院 眼科 作者简介：屈超义，男，在读博士，研究方向：眼底病的基础与 临床。 通讯作者：唐罗生，男，教授，博士牛导师，主要从事视网膜病和 白内障的临床和基础研究t a n g l s 5 7 r i p s i n a c o m 收稿日期：2 0 0 8 - 0 4 - 1 0修回I ：1 期：2 0 0 8 - 0 5 - 1 2 C o n s t r u c t i o na n ds c r e e n i n go fs h R N A e x p r e s s i o np l a s m i d st a r g e t i n gC D l0 5 s i g n i f

3、i c a n tc h a n g e s i na n o t h e rs h R N Aa n du n s p e c i f i c s h R N At r a n s f e c ta n do n l yw i t ht r a n s f e c t i o nr e a g e n tt oB N r a tC N Vm o d e I C O N C L U S I O N ：M e t a f e c t e n ec a nt r a n s f e c tP g e n e s i l - 1 i n t ot h er e t i n ao ft h eB Nr

4、 a te f f e c t i v e l y a n dt h e i re x p r e s s i o nc a nm a i n t a i n4w e e k sa f t e rt r a n s f e c t i o n T h r e e r e c o m b i n a n t se x p r e s s i n gC D l 0 5s h R N Aa r es u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d ，s h R N As e q u e n c e sp o t e n t l yi n h i b i t i

5、 n gC D l 0 5 a r es c r e e n e do u ts u c c e s s f u l l yt o o w h i c hI e n d si t s e l ft o n e wg e n et h e r a p yf o rC N V K E Y V V O R D S ：C D l 0 5 ；p l a s m i d ；s h o r th a i r p i nR N A ；R N A i n t e r f e r e n c e ：c h o r o i d a ln e o v a s c u I ar z a t i o n C h a o

6、Y iQ u ，L u o S h e n gT a n g i e - X iZ e n g B a i - H 岫s Q h R N u c Y A e x p T a n 础g L S n p l , Z e a n s g m J i d s X , e 吲ta 1 i 等n c s 。t r l 0 5 u c t i o n 川a n d 翟 C h e n ，J i n gL u o ，W e iW e i ，W e n - 3 mW a n g r G u o l i 谲k ez I 曲i L ) 2 0 0 8 ；8 ( 6 ) U ：1 1 2 U 6 - 1 1 2 9

7、l F o u n d a t i o ni t e m s ：D o c t o rS u b i c o ts c i e n t i f i eR e s e a r c hF o u n d a t i o n a n dF o u n d a t i o no fI n s t i t u t i o n ( N o 2 0 0 6 0 5 3 3 0 2 6 ) F o u n d a t i o n P r o j e e to fH u n a nP r o v i n c i a lD e p a r t m e n to fS c i e n c ea n dT e c h

8、 n o l o g y ( N o 0 5 F J 3 0 5 7 ) D e p a r t m e n to fO p h t h a l m o l o g y ，t h eS e c o n dX i a n g y aH o s p i t a l ，C e n t r a l S o u t hU n i v e r s i t y C h a n g s h a4 1 0 0 1 1 ，H u n a nP r o v i n c e ，C h i n a C o r r e s p o n d e n c et o ：L u o - S h e n gT a n g D e

9、p a r t m e n to fO p h t h a l m o - l o g y ，t h eS e c o n dX i a n g y aH o s p i t a l ，C e n t r a lS o u t hU n i v e r s i t y ， C h a n g s h a4 1 0 0 1l ，H u n a nP r o v i n c e ，C h i n a t a n g l e 7 r i p s i n a c o r n R e c e i v e d ：2 0 0 8 讲1 0A c c e p t e d ：2 0 0 8 旬5 1 2 A b

10、 s t r a c t A I M ：T oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d se x p r e s s i n g C D l0 5s h o r th a i r p i nR N A ( s h R N A ) b yP g e n e s i l 一1p l a s m i d a n dt os c r e e nt h eh i g h l ye 仟i c i e n ts h R N Ai nB r o w nN o r w a y ( B N ) r a tC N Vm o d e I M E

11、T H O D S ：M e t a f e c t e n ec o n t a i n i n gP g e n e s i l - 1w a s i n j e c t e di n t os u b r e t i n a Is p a c ei nt h ee y e so fB Nr a t L o c a l i z a t i o no fG F Pw a so b s e r v e db yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y F o u rr e c o m b i n a n tP g e n e s i l - 1w i

12、 t hU 6p r o m o t e r w e r ec o n s t r u c t e d 3t a r g e t i n gr a tC D l 0 5a n d1u n s p e c i f i c F i n a l l y ，t h ep l a s m i d sw e r ei d e n t i f i e db ys e q u e n c e a n a l y s i s T h r e er e c o m b i n a n tp l a s m i d sb e i n gt r a n s f e c ti n t o B Nr a tC N Vm

13、o d e l t h ee x p r e s s i o no fC D l0 5m R N AI e v e l w a sd e t e r m i n e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r i z ec h a i n r e a c t i o n2w e e k sI a t e r R E S U L T S ：O R ed a ya f t e rt r a n s f e c t i o n g r e e nf l u o r e s c e n c ew a so b s e r v e di

14、 nt h er a t sr e t i n ai n e l u d i n gR P Ec e l l s u n d e rf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e T h ei n t e n s i t yb e c a m e s t r o n g e ro nt h es e c o n da n dt h i r dw e e kt h a nt h a to nt h e f i r s tw e e k a n ds u s t a i n e df o r4w e e k s T h eC D l 0 5s h R N A s

15、w e r es u c c e s s f u l l yi n s e r t e di n t op l a s m i dP g e n e s i l 一1 T h e r e c o m b i n a n t sw e r ei d e n t i f i e db ys e q u e n c i n g C o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o l s t h ee x p r e s s i o no fC D l0 5m R N AI e v e I n B Nr a tC N Vm o d e lt r a n s f e c tw

16、 i t hC D l0 5s h R N A r e c o m b i n a n t sw a sm a r k e d I Yd o w n - r e g u I a t e d ( 7 8 5 ) ( P 0 0 1 ) a n d ( 5 2 3 ) ( P 0 0 1 ) r e s p e c t i v e l yi nt w o g r o u p so fr e c o m b i n a n tp l a s m i d s w h e r e a si th a dn o ta n y 1 1 筋 摘要 目的：使用P g e n e s i l 1 质粒构建C D

17、l 0 5 R N A 干扰重组体， 在激光诱导B N 大鼠脉络膜新生血管模型中，筛选高效抑 制C D l 0 5 基因表达的s h R N A 。 方法：根据C D l 0 5 基冈序列信息设计了3 条s h R N A 以及l 条非特异阴性序列，利用含U 6 启动子的表达质粒P g e n e s i l 1 构建其R N A 干扰重组体。采用视网膜下注射的方法 使s h R N A 表达质粒转染大鼠视网膜和脉络膜，观察质粒 所携带绿色荧光蛋白基阑表达情况。根据不同的表达质 粒对B N 大鼠C N V 模型2 w k 时C D l 0 5 基因m R N A 表达的 抑制效果与空白对照及仅

18、加转染试剂组比较分析，筛选有 效的抑制序列。 结果：转染后l d ，在荧光显微镜下可见有明显的绿色荧光 分布于实验眼视网膜全层，包括R P E 层。2 3 w k 荧光强 度比1 w k 增强，并持续表达4 w k 。空白对照眼无绿色荧光 表达。构建了3 条C D l 0 5 s h R N A 和阳性对照P g e n e s i l H K ， 基因测序证实目的序列成功插入质粒P g e n e s i l l 中。研究 发现不同的质粒转染后对C D l 0 5 在C N V 高峰期的表达干 预效果不同。P g e n e s i i e s 2 和P g e n e s i l e 9

19、3 可明显抑制 C N V 模型在2 w k 时C D l 0 5 m R N A 的表达，抑制效率分别为 ( 7 8 5 ) ( P 0 0 1 ) ；( 5 2 3 ) ( P 0 0 1 ) 。转染 P g e n e s i l - e n g l ，P g e n e s i l - H K 组及仅加转染试剂组与空白对 照组相比C D l 0 5 m R N A 表达水平无明显变化。 结论：在阳离子脂质体辅助下，P g e n e s i l 1 质粒可以成功地 将目的基因转染至大鼠视网膜各层次，且表达强度高，时 间长于4 w k 。P g e n e s i l e n 9 2 能

20、明显抑制B N 大鼠视网膜组 织C D l 0 5m R N A 的表达。 关键词：C D l 0 5 ；质粒；短发夹砌魄；R N A 干扰；脉络膜新 生血管 屈超义，唐罗生，曾杰西，等C D l 0 5 特异性s h R N A 表达质粒的 构建和筛选国际眼科杂志2 0 0 8 ；8 ( 6 ) ：1 1 2 6 - 1 1 2 9 0 引言 脉络膜新生血管( c h o r o i d a ln e o v a s c u l a r i z a t i o n ，C N V ) 是 I n tJO p h t h a l m o l 。V 0 1 8 。N o 6 ，J u n 2 0

21、0 8W W W 1 J O c n T e l ：0 2 9 - 8 2 2 4 5 1 7 28 3 0 8 5 6 2 8E n t a i l ：I J O 2 0 0 0 1 6 3 c o m 指由多种病因所致的脉络膜新生血管芽穿越B r u c h 膜并 在视网膜色素上皮下和或上增殖形成的纤维血管组织， 目前已成为国内外老年人群中首要的致旨性眼病。“，其发 病机制仍不清楚。随着对血管新生相关研究的深入， C D l 0 5 基因近年来逐渐受到学者的关注旧。C D l 0 5 基 因在新生血管生成的组织的内皮细胞中特异性高表达， 是内皮细胞增殖的相关标记物_ J ，也是血管生成所必

22、须 的HJ 。R N A 干扰( R N Ai n t e f f e r e n e e ，R N A i ) 可以特异地使 特定基凶沉默，进而下调相应蛋白质的表达及功能。由 于R N A i 具有高度的序列专一性和高效的干扰活力，不同 位置设计的s i R N A 片段，作用有显著差异。冈此，需设计 3 4 个不同的s i R N A 片段，从巾筛选效率最高的片段。本 研究针对C D l 0 5 基因序列分别设计了3 条s h R N A 以及l 条 非特异阴性序列，利用含U 6 启动子的质粒成功构建其R N A 干扰重组体，通过B N 大鼠C N V 模型以筛选有效的抑制序 列，为进一步

23、研究C D l 0 5 基冈在脉络膜新生血管形成巾的 作用以及探索脉络膜新生血管形成的基因治疗奠定基础。 1 材料和方法 1 1 材料B N ( B r o w nN o r w a y ，棕色挪威) 大鼠，9 l l w k 龄，体质量约2 2 0 9 ，雌雄不拘，购自北京维通利华实验动 物有限公司，由巾南大学湘雅二医院动物实验中心饲养。 质粒P g e n e s i l 1 ( 含绿色荧光蛋白、耐卡那霉素、抗新霉素 基因及u 6 启动子) 购自武汉晶赛生物1 ：程技术有限公 司。脂质体转染试剂M e t a f e e t e n e 购自德国B i o n t e x 公司； 眼科手术

24、显微镜( 苏州医疗仪器厂) ；荧光显微镜( 日本 N i k o n 公司E 6 0 0 ) ；眼科显微手术器械( 光明神医疗器械公 司) ；5 1 上L 微量进样器( 上海医用激光仪器厂) ；玻璃毛细 管针( 自制) ；脑立体定位仪( 安徽淮北正华生物仪器设备 有限公司) ；3 0 G 注射针头( 美国B D 公司) 。恒冷箱切片 机( L e i e aC M l 8 0 0 型) ，P C R 反应用预混b u f f e r2XT a qP C R M a s t e r M i x ( 购白天为时代科技有限公司) ；p U CM i xM a r k e r 8 购自M B I 公司

25、；G e n e A m p 四P C RS y s t e m2 7 2 0P C R 扩增仪 ( A p p l i e dB i o s y s t e m 公司) ；R e v e r A i de D N A 第一链合成试 剂盒购自M B I 公司。电泳仪和凝胶成像系统( B i oR a d 公 司) ；P C R 引物南上海生工生物工程技术服务有限公司合 成；基因测序由上海生工生物r ：程技术服务有限公司完成。 1 2 方法靶向C D l 0 5 的发夹式s i R N A 的设计根据G e n b a n k 中报道的大鼠C D l 0 5 的基因序列( N M 一0 0 1

26、0 1 0 9 6 8 ) ，参考s i R N A 的设计策略，分别设计3 条s h R N A 序列，使用B L A S T 将选定的序列和相应的大鼠基冈组数 据库进行比较，排除和其他编码序歹t J E S T 同源的序列。 另设计l 条阴性对照，与已知的人、大鼠基因无同源性。 P g e n e s i l 1 质粒中在U 6 启动子后连接针对C D l 0 5 基因的 干扰片段，反义片段以后接r I f I 唧，以终止转录。1 2 只 B N 大鼠右眼行视网膜下注射作为实验组，左眼不做任何 处理作为对照组。参照文献 7 ，8 ，将脂质体M e t a f e e t e n e 与P

27、g e n e s i l e n g l 质粒( 1 9 L ) 按3 ：1 的比例混匀静置 3 0 m i n 后备用。B N 大鼠i p 注射1 0 1 3 I g L 水合氯醛麻醉后， 固定于脑立体定位仪上。在眼科手术显微镜下进行操作。 在大鼠角巩膜缘约1 2 点方位剪开球结膜，做纵型切口，并 向两侧沿角巩膜缘扩展做约1 8 0 。结膜切口。分离筋膜， 暴露后极部巩膜。使用3 0 G 针头，沿切线方向刺人近视 网膜后极部巩膜，达视网膜下间隙，然后用带玻璃丝针头 的5 斗L 微量注射器沿此l , - f L 插入，于视网膜下空间缓慢 注射4 斗L 质粒与M e t a f e e t e

28、 n e 的混合物，对照组只注射 M e t a f e c t e n e4 1 x L 。停留约3 0 s ，轻轻抽出针头。每眼注射2 孔。观察有无晶状体损伤、视网膜脱离及玻璃体视网膜出 血等情况。用诺氟沙星滴眼液滴眼以防止伤口细菌感染， 表1 实验所用引物 目的基因I ：游序列( 5 一3 )F 游序列( 5 一3 )产物大小 C D l 0 5A T C C A A C A C C A7 1 1 A G A G C T A GT G G C T G A G G G G A C A A G 1 3 “ C6 1 4b p G A P D HA C C A C A C T C C A T

29、G C C A T C A CG G A C G G C T Y G A A G A T A T A4 3 9b p 葡c “ c M V 5 VTKp。IYA聂PGenesil簧l i 4 8 9 3 b pD “， K a n 刷e 0 “弋一M l u 心。篇愁邮：罗掣 图1质粒P g e n e s i l - 1 结构示意图 2 次d ，持续7 d 。于注射后l d ；l ，2 ，3 ，4 w k 过量麻醉处死 3 只大鼠取眼球，将新鲜摘出的B N 鼠实验眼和对照眼以 角膜面朝上埋在持物器卜的O C T 组织包埋液中，待O C T 液凝结，用锐利刀片于距角膜缘处1 5 m m 将眼球

30、前段切 除，再进行切片，片厚6 1 x m 。把贴有切片的载玻片放入甲 醇中同定3 0 m i n ，荧光旺微镜( 发射波长含4 8 8 n m ) 下观察 绿色荧光蛋白的表达，数码相机照相。B N 大鼠3 6 只，右 眼作为实验眼，按照f 洵等一。的方法建立激光诱导的 C N V 模型。之后随机分为6 组，每组6 只，l d 后于视网膜 下注射s i R N A 表达质粒，依据不同处理分为P g e n e s i l e n g l 组，P g e n e s i l e n s 2 组，P g e n e s i l e l l 9 3 组，P g e n e s i l - H K 组

31、，阳性 对照组( 仅注射M e t a f e e t e n e ) ，空白对照组( 未行注射) 。 于基因转染后2 w k ，将各组大鼠过量麻醉处死后摘除眼 球，获取实验眼和对照眼的视网膜和脉络膜组织。立即置 于液氮罐中保存待检。根据G e n b a n k 提供的资料( C D l 0 5 基因索取号N M 一0 0 1 0 1 0 9 6 8 ) ，使用软件P r e m i e rP r i m e r5 设计引物。G A P D H 作为内参用于证明各标本的存在与标 准化( 表1 ) 。组织总R N A 提取采用T r i z o l 试剂。所获得 的组织总R N A 采用紫外吸

32、收法进行R N A 定量，各组样品 R N A 的A 2 6 0 A 2 8 0 吸光度均在1 8 2 0 之间。使用 R e v e r A i de D N A 第l 链合成试剂盒合成第l 链e D N A ，保存 于- 2 0 0 C 。P C R 扩增体系2 5 斗L 。加入2XT a qP C RM a s t e r - M i x 溶液1 2 5 恤L 、上下游引物各0 2 5 卜L ，e D N A 模板2 斗L ， 双蒸去离子水补足体积至2 5 斗L 。扩增条件为9 4 0 C 5 m i n ，1 个循环；9 4 6 0 s 。6 0 6 0 s ，7 2 9 0 s ，3

33、 0 个循环；7 2 终延 伸1 5 m i n 。产物检测：取P C R 产物5 1 r L ，含G o l d V i e w T M D N A 染料的1 0 L 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，经凝胶成 像系统进行拍照并进行吸光度积分扫描，测定扩增带吸光 度值( A ) ，C D l 0 5 积分灰度值G A P D H 积分灰度值，所得 值为C D l 0 5 m R N A 相对表达值。 统计学处理：数据均以均数4 - 标准差( 元s ) 表示， S P S S l 3 0 统计分析软件包进行数据处理。各组间 C D l 0 5 m R N A 表达比较用单因素方差分析。以P 0 0

34、 5 表示差异有统计学意义。 2 结果 2 1C D l 0 5 特异性R N A 干扰表达质粒的构建根据s i R - N A 设计原则及G e n b a n k 提供的C D l 0 5 基因序列信息 ( N M 一0 0 1 0 1 0 9 6 8 ) ，设计了3 条针对大鼠C D l 0 5 基冈的 s i R N A ，命名为P g e n e s i l - e n g l ，P g e n e s i l e l l s 2 ，P g e n e s i l e l l s 3 。 l 条非特异的s i R N A 命名为P g e n e s i l H K ( 图1 ) 。

35、拟插入 国际眼科杂志2 0 0 8 年6 月第8 卷第6 期W 、 ，w U O c n 电话：0 2 9 - 8 2 2 4 5 1 7 28 3 0 8 5 6 2 8电子信箱：U O 2 0 0 0 1 6 3 c o m 际疆丽丽丽甄面面而面酾葡广一忡际面面硫丽丽勇丽丽珏葡丽玎一 I l Ol Z 01 3 0I 4 0 1 01 2 01 3 01 4 0 c - G o TC6 G T TG TcTcT cc c T cT 1c - TGTc T T TcC 6 o6L CG T c T1 龇 一舭 际苹订丽丽丽丽丽巍甩晡嘲一一争k B 0 6 1 0 1 4 0 眦2 - O E

36、 l ( 3 0 ) P E G I r P - N _ l v g , 圈2p l a s m i d 的测序图谱( 部分)、：恬1 1 ( i l ”1 9 l ；I ；岫一i l - t r i 9 2 ：C ：P 刖- i h n 邸：n ：啮一m I l K 图3C D l 0 5 - G F P 质粒脂质体复合物视网膜下注射后荧光显微镜观察( X 4 0 0 )、：l 1 ；I ；：二、k ：( ：4 、L 图4 不同s h R N A c fC D l 0 5 m R N A 和G A P D H 表达的影响 A ：C D l 0 5m R N A ；B ：G A P D H ；

37、M ：M a r k e r ，l ：空白对照；2 ：P g e n e s i l - e n g l ；3 ： P g e n e s i l - e s 2 ；4 ：P g e n e s i l - e n s 3 ；5 ：P g e n e s i l - H K ；6 ：阳性对照 的寡核苷酸序列为：E n g lA A A G A G T C G G l T r G T G A T C T A C ； E n 9 2C T G A A T C 下r r C C A G A A G G A ；E n 9 3 T C G T C T T C A l T r T C G A A C G

38、A ；H KG A C T T c A T A A G G C G C A T G C 。基因钡4 序 证实目标寡核苷酸序列均已正确插入，C D l 0 5 特异性 R N A 干扰表达质粒的构建成功( 图2 A ，B ，C ，D ) 。 2 2 G F P 表达情况荧光显微镜下，实验组眼球在转染后 l d 即可见质粒所表达的绿色荧光分布于视网膜全层包括 R P E 细胞层，不仪注射点附近全层视网膜旱强绿色荧光， 远处局部外层视网膜也有荧光表达( 图3 A ) ，表明 C D l 0 5 s i R N A 质粒沿视网膜下腔成功转染了更远处的外 层视网膜细胞；2 3 w k 荧光强度比1 w

39、k 增强，荧光范围也 有所扩大( 图3 B ) 。4 w k 仍可以看到荧光的持续表达( 图 3 C ) ，强度稍有减弱。对照眼无G F P 表达，说明利用脂质体 成功介导C D l 0 5 转染至视网膜全层的细胞，包括视网膜色 素上皮细胞，且C D l 0 5 有较高水平表达，时间可达4 w k 。 2 3 高效C D l 0 5 s i R N A 的筛选P g e n e s i l - e n 9 2 组和P g e n e s i l e n 9 3 组C D l 0 5 m R N A 表达较空白对照组明显降低( 表 1 1 约 表2 各组2 w k 时C D l 0 5 m R

40、N A 的表达 分组C D l 0 5 m R N A ( A C D I O S m R N A A c P D H ) 空白对照组 P g e n e s i l - e n g l P g e n e s i l - e n 9 2 P g e n e s i l e n S 3 P g e n e s i l - H K 阳性对照组 0 8 9 士0 1 0 0 8 4 0 0 8 0 1 8 0 0 5 0 3 4 - I - 0 0 7 O 8 2 O 0 9 0 8 6 0 0 7 2 ，图4 A ) 。转染P g e n e s i l e n g l 、非特异s h R N

41、A 组C D l 0 5 m R N A 表达较空白对照组无明显变化( 图4 B ) 。P g e n e s i l e s 2 组的抑制效率为( 7 8 5 ) ( t = 1 6 2 ，P 0 0 1 ) ；P g e n e s i l e n 9 3 组的抑制效率为( 5 2 3 ) ( t = 1 1 5 ，P 0 0 1 ) 。 3 讨论 目前，抑制新生血管的生成是C N V 防治研究的中心。 研究发现C D l 0 5 基因在增殖的血管内皮特异性高表达， I n tJO p h t h a l m o l ，V 0 1 8 N o 6 ，J u n 2 0 0 8W W W I

42、 J 0 c a T e l ：0 2 9 - 8 2 2 4 5 1 7 28 3 0 8 5 6 2 8E m a i l ：I J O 2 0 0 0 1 6 3 c o r n 而且是血管生成所必须的。徐建峰等。的研究显示， C D l 0 5 在C N V 形成过程巾可能起重要作用，C D l 0 5 分子 可能成为C N V 治疗中一个有希望的新靶点。R N A 干扰是 近年来出现的一种新技术，其作用机理是通过导人双链 R N A ，引起生物体或细胞内同源m R N A 的降解，下调相应 蛋白的表达水平和功能。由于R N A 干扰具有特异性，效 力强大，所以已成为基因治疗的理想手段

43、。目前s i R N A 的 制备方法主要有化学合成，体外转录法合成，s i R N A 表达 框架，s i R N A 表达载体等多种。化学合成法可以获得大量 的高纯s i R N A ，由于其价格高、订购时间长而仅仅适J f j 于 已经确定最有效靶序列的s i R N A 的研究工作。而体外转 录法方便快捷，适合进行s i R N A 靶序的筛选或同时制备多 种s i R N A 。同时由于上述两方法制备的s i R N A 转染效率 低，抑制作用短暂，并且易于污染R N A 酶而降解，因此其 应用受到限制。而发夹式s i R N A s 表达载体成本较低，且 转染靶细胞后可持续表达发夹

44、式s i R N A ，发夹式s i R N A 可 以在细胞内R N A 酶的作用下被切割成与体外合成的s i R - N A 相同的序列与结构，诱导R N A i 效应，使R N A i 下凋特 定基冈的表达作用时间更长、更稳定。“”j 。之前的研究 结果一”。提示B N 大鼠C N V 模型巾新生血管发生的高峰 为光凝后1 4 ，2 8 d 后明显消退。冈考虑短时间的干预恐难 以收到确切效果，所以选择s h R N A 表达载体进行干预。 徐建峰等u 叫的研究显示C D l 0 5 基凶表达的高峰在建模后 1 4 d 左右。所以我们选择在这个时间点根据不同的 C D l 0 5s i R

45、 N A 对B N 大鼠C N V 模型C D l 0 5 m R N A 表达的 干预效果以确定最为有效的C D l 0 5 s h R N A 序列。本研究 筛选出2 个可以高效抑制大鼠C D l 0 5 基因m R N A 表达的 s h R N A ，其中P g e n e s i l e n 9 2 的干扰效果尤其明显。 基因治疗不仅要选择适宜的治疗基冈和靶细胞，也需 要通过合适的方式将治疗基冈导人靶细胞，使基冈在体内 有效的表达，才能达到治疗目的。将治疗基凶导人体内的 方法有生物学方法和非生物学方法两大类。生物学方法 主要借助各种载体将外源基因导人靶细胞，非生物学方法 主要有脂质体

46、介导基冈转移、直接注射、受体介导基凶转 移等。病毒载体阒有潜在的致突变性，安全性受到质疑。 非病毒载体具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、 无基因插入片段大小限制，以及使用简单、制备方便、便 于保存和检验等优势。我们采用新型阳离子脂质体M e l a f e c t e n e 作为基阂转移的载体。脂质体由磷脂类分子组成， 可在水中形成小囊，通过细胞吞噬或融合作用将其内容物 传递至细胞中。阳离子脂质体外部带正电荷，而细胞膜带 负电荷，故用作为基冈的载体，既有利于包裹D N A 分子， 也使脂质体易与细胞膜融合”1 ，经细胞的胞饮或受体介 导作用进入细胞内。我们利用带有绿色荧光蛋白基因的

47、质粒作为s h R N A 的表达载体，可以通过观察绿色荧光蛋 白的表达了解s h R N A 的表达部位和持续时间。我f J 采用 的s h R N A 表达载体P g e n e s i l l 是以U 6 启动子为基础构建 的真核系统的表达载体。由于U 6 肩动子几乎所有元件 均位于转录起始区的上游，只要将编码一小段对应目的基 因特异序列的、其R N A 能形成发夹结构( 回文结构) 的 D N A 序列插人载体中U 6 启动子的下游就能稳定表达出 发夹结构的R N A 。本研究经D N A 测序证明插人序列大 小、位点和方向均是正确的。 实验结果证实，我们所构建的s h R N A 表

48、达载体在脂 质体辅助下不但能将外源性基因转染到眼内，而且转移速 度很快，在注射后l d 即町通过荧光旺微镜观察到全层视 网膜有G F P 的表达，其表达在2 3 w k 时达到高峰，在第 4 w k 仍然很明显，说明P g e n e s i l e n g l 所携带的日的基冈和 G F P 在视网膜组织包括视网膜色素上= 皮层内能够稳定表 达至少4 w k ，进而证实了视网膜下注射重组表达质粒和脂 质体是可靠的给药方式。此靶向s h R N A 表达载体能将外 源性基因迅速、广泛且显著地转染到整体活细胞，且持续 时间较长，冈此可以更好的达到治疗目的。较注射药物或 蛋门需反复多次给药具有明显的优势。这说明利用脂质 体辅助s h R N A 表达载体进行视网膜及脉络膜疾病的基因 治疗在实践巾是可行的。我们的结果显示P g e n e s i l e n s 2 和P g e n e s i l e n 9 3 对C D l 0 5 的表达具有较强的抑制作用，而 其他序列无明显效果，这说明了R N A 干扰的序列特异性。 其巾P g e n e s i l e n 9 2 的体内抑制效率约为7 8 ，虽然不排除 将来可能发现更为有效的序列，但这样的抑制效率已令人 满意。本实验研究为今后进一步探讨C D l 0 5 在新生血管 性眼病发病机制中的作用及应用于治疗奠定了基础。