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1、文章编号： 1 0 0 2 - 2 6 9 4 （2 0 0 5） 0 7 - 0 6 0 8 - 0 3 O 1 3 9群霍乱弧菌地方分离株的分子特征研究* 李孝权1， 王鸣1 *， 易鸿1， 刘于飞1， 黄冰1， 周端华1， 莫自耀1， 欧忠辉2， 柴巧学2， 刘衡川3， 蒋力云1， 刘远1 摘要： 目的研究本地分离出的O 1 3 9群霍乱弧菌的分子特征， 建立霍乱暴发和散发的快速检测及流行病学溯源的有 效手段。方法采用P C R方法对霍乱弧菌进行4种毒力基因的检测， 用随机扩增多态性分析 （R A P D） 及S P S S软件对以上菌 株进行多态性分析， 对霍乱弧菌毒力进行快速测定和分
2、子分型。结果 5株O 1 3 9群霍乱弧菌均可检出四种毒力基因。所有 霍乱弧菌的R A P D结果经聚类分析可分为3个聚类群， 较好地反应了不同群的霍乱弧菌之间的亲缘关系。结论可将P C R 和R A P D方法结合分析用于霍乱疫情的快速检测和流行病学溯源。 关键词： 霍乱弧菌， 毒力基因， P C R， 随机扩增多态性分析 中图分类号： R 3 7 8 . 3 文献标识码： A M o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e l o c a l i s o l a t e s o f V i b r i o c h o l
3、e r a es e r o g r o u p1 3 9 L IX i a o - q u a n，WA N GM i n g，Y IH o n g，L I UY u e - f e i，H U A N GB i n g，Z H O UD u a n - h u a， MOZ i - y a o，O UZ h o n g - h u i，C H A IQ i a o - x u e，L I UH e n g - c h u a n，J I A N GL i - g u n，L I UY u a n （G u a n g z h o uC e n t e r f o rD i s e a s
4、e sC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n， G u a n g z h o u，5 1 0 0 8 0，C h i n a） A B S T R A C T：T h em o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o fV i b r i o c h o l e r a es e r o g r o u p 1 3 9w a s i n v e s t i g a t e d i n o r d e r t o s e a r c h f o r a r a p i d d e t e c - t i
5、o nm e t h o do f c h o l e r a o u t b r e a ka n d t h e e f f e c t i v em e a n s o f c o n d u c t i n g e p i d e m i o l o g i c a l s o u r c e - t r a c k i n g . P C Rw a s a d o p t e d t o d e t e c t 4 v i r u l e n c e g e n e s o fV.c h o l e r a ea n d t h e r a n d o ma m p l i f i
6、e d p o l y m o r p h i cD N A（R A P D）a n dS P S S s o f t w a r ew e r e u t i l i z e d t o c o n d u c tD N A p o l y m o r p h i s ma n a l y s i s o f t h e l o c a l i s o l a t e s s o t h a t t h e r a p i d d e t e c t i o n a n dm o l e c u l a r s u b t y p i n g o f t h e s e i s o l a
7、t e s b e c a m e p o s s i b l e . I tw a s f o u n d t h a t 4v i r u l e n c e g e n e sw e r e d e t e c t e d f r o me a c h o f t h e 5 i s o l a t e s o fV.c h o l e r a es e r o g r o u p 1 3 9，a n d a l l t h e i s o l a t e s c o u l db e c l a s - s i f i e d i n t o 3g r o u p s b yR A P
8、 D，r e f l e c t i n g t h e r e l a t i o n s h i p o f d i f f e r e n t s e r o g r o u p s o fV.c h o l e r a e. I n c o n c l u s i o n，i t i s e v i d e n t t h a t P C R， t o g e t h e rw i t hR A P Dc a nb e u s e d f o r t h e r a p i dd e t e c t i o no f e p i d e m i c s i t u a t i o na
9、 n d f o r t h e e p i d e m i o l o g i c a l s o u r c e - t r a c k i n g . K E YWO R D S：V i b r i o c h o l e r a，v i r u l e n c e g e n e，P C R，r a n d o m l y a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cD N Aa n a l y s i s （R A P D） 对霍乱弧菌进行快速、 准确的检测及分型是控 制霍乱流行的重要手段之一。多年来国内有关实验 室在对霍乱弧菌的研究方面进行了不懈的努
10、力， 分 子生物学以及相关测试方法的飞速发展为霍乱弧菌 的快速检测提供了新的手段。聚合酶链反应 （P C R） 和随机扩增多态性分析 （R A P D） 是对细菌进行快速 鉴定和分型的简便、 快速、 有效的手段 1 。本研究 采用P C R和R A P D技术进行霍乱弧菌的毒力基因 检测和分型， 试图将其应用于霍乱的突发事件中， 以 便为该病暴发和散发的流行病学溯源和疫情控制提 供有效的手段。 1 材料与方法 1 . 1 菌株及来源 本次研究所采用的7个分离株均采集自广州本地区， 其 相关资料详见表1。 T a b l e . 1V.c h o l e r as t r a i n s o f
11、 t h eO 1、O 1 3 9s e r o g r o u p s 菌株 血清型来源分离年份 V C 1O 1P a t i e n t a t t h e o u t b r e a k l o c u s 12 0 0 2 V C 2O 1P a t i e n t a t t h e o u t b r e a k l o c u s 12 0 0 2 V C 3O 1 3 9 P a t i e n t a t t h e o u t b r e a k l o c u s 22 0 0 4 V C 4O 1 3 9 t h e t o i l e t i s o l a t e
12、 a t t h eo u t b r e a k l o c u s 2 2 0 0 4 V C 5O 1 3 9 P a t i e n t a t t h e o u t b r e a k l o c u s 32 0 0 3 V C 6O 1 3 9 P a t i e n t a t t h e o u t b r e a k l o c u s 32 0 0 3 V C 7O 1 3 9 P a t i e n t a t t h e o u t b r e a k l o c u s 32 0 0 3 1 . 2 试剂与仪器 W i d eR a n g eD N AL a d
13、 d e rM a r k e r，1 0 0 b p D N AL a d d e rM a r k e r、P r e m i xT a q成套试剂、T a q D N A聚合 *基金项目： 广东省医学科研基金项目 （N o . A 2 0 0 2 9 5 7） 作者单位： 1 .广州市疾病预防控制中心， 广州5 1 0 0 8 0； 2 .遵义医学院口腔医学系； 3 .四川大学华西公共卫生学院医检教研室 *通讯作者 806 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5，2 1（7） 酶、
14、 1 0 *P C RB u f f e r （ M g 2 +F r e e） 、 d N T PM i x t u r e、M g C l 2、6* L o a d i n gB u f f e r均购自T a K a R a宝生物工程 （大连） 有限公司。 超纯琼脂糖和1 0*T B E缓冲液购自i n v i t r o g e n公司。P T C - 2 2 0型基因扩增仪购自M JR e s e a c h公司， 高速冷冻离心机 购自法国J o u a n公司。 1 . 3 引物设计与合成用于P C R检测霍乱弧菌毒力基因 的4对引物分别针对a c e、 t c p A、c t x
15、 A、z o t， 随机扩增多态性分 析O 1 3 9霍乱弧菌同源性的单条引物为霍乱弧菌 a p 引物 1 ， 5种引物均由上海生工生物工程公司合成， 其序列、 扩增产 物分子量及编码产物名称见表2。 表2毒力基因扩增所用引物 T a b l e . 2 S e q u e n c e s o f p r i L e r s u s e d f o r a L p l i f y i n g t h e v i r u l e n c e g e n e s 目的基因 T a r g e t g e n e 序列 N u c l e o t i d e s e q u e n c e （5-
16、3 ） 扩增产物 A m p l i c o n s i z e （ b p ） 编码产物 C o d i n gp r o d u c t a c e T A AG G AT G TG C TT A TG A TG G AC A CC C C G TG A TG A AT A AA G AT A CT C AT A GG 2 8 9A C E t c p A C A CG A TA A GA A AA C CG G TC A AG A G C G AA A GC A CC T TC T TT C AC A CG T TG 4 5 3T C P c t x A C G GG C AG A TT
17、 C TA G AC C TC C TG C G AT G AT C TT G GA G CA T TC C CA C 5 6 4C T z o t T C GC T TA A CG A TG G CG C GT T TT A A CC C CG T TT C AC T TC T AC C CA 9 4 7Z O T a p C C GC A GC C AA- 1 . 4 检测方法 1 . 4 . 1 D N A模板的制备 首先将霍乱弧菌转至4号平板， 得到纯化的单个菌落， 取灭菌重蒸水制备1 0 0 l霍乱弧菌菌 悬液， 将其置于干式恒温器上1 0 0 加热1 0 m i n， 然后于1 2
18、 0 0 0 r m i n离心1 0m i n， 取上清液作为P C R毒力基因测定和 R A P D多态性分析的D N A粗制模板。 1 . 4 . 2 毒力基因的测定反应总体系为3 5 l， 体系中含 P r e m i xT a q （包括P C RB u f f e r、T a K a R aT a q 1 . 2 5 U， d N T P M i x t u r e各0 . 4 mM、 M g 2 +3 mM） 、 引物各1 0 M、 细菌D N A粗 制模板2 . 0 l。P C R循环参数：9 4 预变性3m i n，9 4 1 m i n、6 0 1m i n、7 2 1m
19、i n循环3 0次，7 2 延伸1 0m i n， 然 后取扩增产物1 0 l在1 . 5 %琼脂糖凝胶上电泳 （8 V c m） ， 经 溴化乙淀染色， 用A l p h a I m a g e r T M凝胶成像系统成像。 1 . 4 . 3 R A P D分析O 1 3 9霍乱弧菌的同源性 利用霍乱弧 菌 a p 引物对上述菌株进行随机扩增多态性分析。反应总体 系为3 5 l， 体系中含1 0*b u f f e r 3 . 5l、 引物2 0M、M g C l 22 . 5 mM、d N T P各2 . 5 mM、T a q酶1 . 5 U、 细菌D N A粗制模板 2 .0l。P C
20、 R循环参数：9 4 预变性3 m i n，9 4 1m i n、3 6 1 m i n、7 2 1 m i n循环3 0次，7 2 延伸1 0m i n， 取扩增产物 1 0l在1 . 5 %琼脂糖凝胶上 （含有E B0 . 5g m l） 电泳 （8 V c m） ， 同时采用W i d eR a n g eD N AL a d d e rM a r k e r进行电泳， 用 A l p h a I m a g e r TM凝胶成像系统成像。 1 .4 . 4 聚类分析 A l p h a I m a g e r TM凝胶成像系统得到 R A P D图像后， 直接在其软件中根据M a r
21、k e r计算不同扩增 片段的分子量大小， 然后采用S P S S统计软件， 利用组间均 联法进行聚类分析。 2 结果 2 . 1 毒力基因P C R扩增结果在所有的7株霍乱 弧菌中， P C R检出4种毒力基因的共5株。图1所 示的V C 3和V C 4两株O 1 3 9群霍乱弧菌经扩增后 均出现预期的2 8 9 b p、 4 5 3 b p、5 6 4 b p和9 4 7 b p四条 特异性扩增条带， 未见非特异性扩增条带， 另外， V C 5、V C 6、V C 7三株O 1 3 9群霍乱弧菌经P C R扩增 后也均出现四条特异性条带。而V C 1和V C 2两株 O 1群霍乱弧菌 （稻
22、叶型） 只出现2 8 9 b和5 6 4 b p两条 扩增条带。 2 . 2 R A P D扩增结果 经R A P D扩增后， 可将供试 的7株菌分成3个聚类群， 扩增产物在71 0条之 间， 所获得片段分子量大小在4 0 030 0 0 b p之间， 结果见图2。 2 . 3 聚类分析结果利用S P S S软件对图2进行 分析表明， 根据遗传距离的差异， 将7株霍乱弧菌分 成了3个聚类群， 每个聚类群内部菌株的遗传距离 基本相同， 如组1（V C 1和V C 2） ， 组2（V C 3和 V C 4） ， 组3 （V C 5、 V C 6和V C 7） 中每一组是同源的， 组2和组3的5株菌
23、都是O 1 3 9群霍乱弧菌， 而组1 的2株菌均为O 1群霍乱弧菌 （稻叶型） ， 因此组2 和组3在聚类图中的位置较为接近， 反映了这2组 菌株的亲缘关系较近。 3 讨论 霍乱为急性肠道传染病， 危害严重， 迄今仍然是 困扰许多国家的公共卫生问题之一。我国各级卫生 机构的研究者们不断致力于病原的检测研究。在基 层实验室只能开展常规的分离培养及血清学鉴定， 这在突发霍乱疫情尤其是需要进行检测和进行流行 病学溯源时， 就不能满足实际需要。 霍乱检测的快速方法如P C R方法简单、 快速、 敏感、 特异， 已开始使用于临床和环境标本中霍乱弧 菌的快速检测。近年来P C R方法和R A P D方法
24、在 霍乱弧菌检测中的应用越来越受到人们的重视。 目 906 2 0 0 5，2 1（7） 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 图1 V C 3和V C 4（O 1 3 9群霍乱弧菌） 毒力基因扩增产物的 琼脂糖凝胶电泳图谱 F i g . 1 A g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sp r o f i l eo fP C Ra L p l i f i c a - t i o no fv i r u l e n c e - a s s o c i
25、 a t e dg e n e so fV C 3a n dV C 4 （O 1 3 9s e r o g r o u pV i b r o c h o l e r a） M：m o l e c u l a rm a r k e r；L a n e 1：2 8 9 b pa m p l i c o no fV C 3； L a n e 2：4 5 3 b pa m p l i c o no fV C 3；L a n e3：5 6 4 b pa m p l i - c o no fV C 3；L a n e 4：9 4 7 b pa m p l i c o no fV C 3；L a n e5：
26、 2 8 9 b pa m p l i c o no fV C 4；L a n e6：4 5 3 b pa m p l i c o no f V C 4；L a n e7：5 6 4 b pa m p l i c o no fV C 4；L a n e 8：9 4 7 b p a m p l i c o no fV C 4 图2 7株霍乱弧菌的R A P D图谱 F i g . 2 R A P Df i n g e r p r i n t o f 7s t r a i n s o fV i b r o c h o l e r a M：m o l e c u l a rm a r k e r；L
27、 a n e 1：V C 1；L a n e 2：V C 2；L a n e 3：V C 3； L a n e 4：V C 4；L a n e 5：V C 5；L a n e 6：V C 6；L a n e 7：V C 7 图3组间均联法7株霍乱弧菌的树状图 F i g . 3 D e n d r o g r a Lu s i n gA v e r a g eL i n k a g e （B e t w e e nG r o u p s） o f 7s t r a i n s o fV i b r o c h o l e r a 前发现的霍乱弧菌致泻毒素主要为霍乱肠毒素 （C T） 、 小带联
28、结毒素 （Z O T） 、 辅助霍乱肠毒素 （A C E） 和毒力协同菌毛蛋白亚单位 （T C P A） ， 而霍 乱肠毒素是霍乱弧菌的主要毒力因子。因此， 检测 C T基因是霍乱病原诊断的重要手段和依据。通过 对这些毒素致病基因的检测， 可了解霍乱弧菌携带 毒力之情况。本研究采用单基因P C R方法对7株 霍乱弧菌临床分离株进行以上4种毒素基因的检 测， 结果从病人分离的5株O 1 3 9群霍乱弧菌均同 时检出4种毒力基因， 而另外两株O 1群霍乱弧菌 （稻叶型） 则只检出2种毒力基因 （c t x A和a c e） ， 表 明不同群的霍乱弧菌携带毒素的差异性。此外， 本 研究试图用多重P
29、C R方法同时扩增4种毒力基因， 但所得带型并不稳定， 如c t x A和a c e的扩增产物有 时较弱甚至看不到， 可能是同一反应体系中由于引 物的增多造成有些基因扩增效率下降， 并需要在不 断的实践中， 改善反应条件， 以达到最佳的结果。 随机扩增多态性D N A技术 （r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i c D N A a n a l y s i s，R A P D）是 分 别 由 W i l l i a m s 1 和W e l s h 2 等建立的基因分析技术， 因其 无须预先了解被测基因组的相关分子生物学背景等 优点而被
30、广泛应用于微生物的分子分型与鉴定， 遗 传图谱构建、 物种亲缘关系的确定以及种群遗传学 等领域的研究 3 - 6 。本文采用R A P D对7株霍乱 弧菌进行随机扩增， 得到较为理想的指纹图谱， 经聚 类分析后， 将供试的7株菌分成3个聚类群， 扩增产 物在7-1 0条之间， 所获得片段分子量大小在4 0 0 - 30 0 0b p之间， 扩增带型清晰明亮， 条带分布合 理， R A P D的带型差异与表型差异是基本吻合的， 说 明本研究所选引物能较好地反映各菌株间的遗传差 异和亲缘关系， 因此， 在对实验条件严格标准化的情 况下， 可利用R A P D对从霍乱疫情暴发和散发中获 得的菌株及环
31、境分离株进行多态性分析， 将有可能 得到众多霍乱菌株的R A P D分子分型数据库， 从而 为霍乱的流行病学调查和溯源提供技术支持， 并提 高疾病预防控制机构对霍乱疫情的预警能力。 参考文献： 1W a r n e r J M，O l i v e r J D. R a n d o m l y a m p l i f i e d p o l y m o r p h i cD N Aa n a l - y s i s o f c l i n i c a l a n de n v i r o n m e n t a l i s o l a t e so fV i b r i ov u l n i f
32、 i c u sa n d o t h e r v i b r i o s p e c i e s . A p p l E n v i r o nM i c r o b i o l，1 9 9 9，6 5 （3） ： 1 1 4 1 - 4 . 2W i l l i a m s JG K，K u b e l i k AR，L i v a kKJ， e ta l . D N Ap o l y m o r p h i s m s a m p l i f i e db ya r b i t r a r yp r i m e r s a r eu s e f u l a s g e n e t i c
33、m a r k e r s . N u c l e i c A c i d sR e s，1 9 9 0，1 8 （2 2） ： 6 5 3 1 . 3W e l s hJ，M e c l e l l a n dM. F i n g e r p r i n t i n gg e n o m e su s i n gP C Rw i t ha r - b i t r a r yp r i m e r s . N u c l e i cA c i d sR e s，1 9 9 0，1 8 （2 4） ： 7 2 1 3 . 4 C h h o t r a yG P，P a lB B，K h u n
34、 t i aH K，C h o w d h u r yN R，e ta l . I n c i - d e n c ea n d m o l e c u l a ra n a l y s i so fV i b r i oc h o l e r a ea s s o c i a t e d w i t h c h o l e r a o u t b r e a ks u b s e q u e n t t ot h es u p e rc y c l o n e i nO r i s s a，I n d i a . E p i d e m i o l I n f e c t . 2 0 0 2
35、，1 2 8 （2） ： 1 3 1 - 8 . 5 吴少慧， 张成刚， 张忠泽， 等， R A P D技术在微生物生物多样鉴定 中的应用 J.微生物学杂志， 2 0 0 0，2 0 （2） ： 4 4 - 4 6 . 6 易鸿， 廖育煌， 刘俊华， 等.R A P D技术分析出血性大肠杆菌 O 1 5 7：H 7， 热带医学杂志 J. 2 0 0 2，2 （2） ： 1 2 4 - 1 2 6 . 收稿日期： 2 0 0 4 - 1 2 - 2 3； 修回日期：2 0 0 5 - 0 2 - 1 6 016 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 5，2 1（7）