OPN和CD44在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中的表达.pdf

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1、2 0 0 9 年l O 月第6 卷第3 0 期 论著 OPN 和C D 4 4 在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中的表达 张连云，和青松2 ，杨军1 ，郭明好1 ( 1 新乡医学院第一附属医院肾病风湿免疫科，河南卫辉4 5 3 1 0 0 ； 2 新乡医学院第一附属医院康复医学科，河南卫辉4 5 3 1 0 0 ) 【摘要1 目的：检测O P N 和C D 4 4 在梗阻性肾病大鼠中的表达，探讨其在肾小管间质纤维化( T I F ) 病变过程中的作用。 方法：利用S D 大鼠行单侧输尿管梗阻( u u o ) 诱导建立r r I F 动物模型，4 8 只S D 大鼠随机分为假手术组( 2 4 只)

2、和模 型组( 2 4 只) 。两组分别于实验第7 、1 4 、2 l 天三个时间点收获动物各8 只。检测上述时间点各组动物肾小管损伤、问 质炎症细胞浸润和纤维化等肾脏组织病理学变化特点，采用免疫组化法观察O P N 、C D 4 4 在梗阻性肾病大鼠中的表达 以及桂枝茯苓胶囊对O P N 和C D 4 4 表达的影响。结果：梗阻性肾病大鼠在上述i 个时间点肾小管间质损伤呈进行性 加重。免疫组化结果显示。O P N 和C D 4 4 在1 t I F 中呈高表达，且随着1 r I F 的进展不断增强。O P N 和C D 4 4 在r 1 1 F 中的表 达同小管问质损伤程度呈正相关( 栅7 8

3、 2 ，P 0 0 1 ；栅7 7 4 ，P 0 0 1 ) 。结论：梗阻性肾病局部O P N 和C D 4 4 表达明显升 高。O P N 和C D 4 4 在肾损伤中的表达上调并介导肾间质巨噬细胞浸润和间质纤维化的发展，二者相互作用参与肾脏 的发病过程。 【关键词1 肾小管间质纤维化；骨调素；C D 4 4 【中图分类号】R - 3 3 2【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 3 - 7 2 1 0 ( 2 0 0 9 ) 1 0 ( c 卜0 1 9 0 3 E x p r e s s i o no fo P Na n dC D 4 4i nr a tk i d n e yw i t

4、hU n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o n z H AN GL i a n y u n I , H EQ i n g s o n f , Y A N G m l 。G U OM i n d 姗J ( 1 D e p a r t m e n to fR e n a la n dR h e u m a t i cI n t e m a lM e d i e i n e ，t h eF i r s tA m l i a t e dH o s p i t a lo fX i n x i a n gM e d i c a lC o l

5、 l e g e ，W e i h u i4 5 31 0 0 ，C h i n a ；2 D e p a r t m e n to fR e h a b i l i t a t i o nM e d i c i n e 。t h eF i r s tA 腋l i a t e dH o s p i t a lo fX i n x i a n gM e d i c a lC o l l e g e ， W e i h u i4 5 31 0 0 。C h i n a ) A b s t r a c t 】0 b j e c t i v e ：T od e t e r m i n et h ee

6、x p r e s s i o no fO P Na n dC D 4 4i nr a tk i d n e yw i t ho b s t r u c t i v en e p h m p a t h y ，a n di n v e s t i g a t et h ep o t e n t i a lr o l eo fO P Na n dC D 4 4i nt h ep a t h o g e n e s i so ft h et u b u l o i n t e r s t i t i a lf i b r o s i s0 3 nn e p h m p a t h yi n r a

7、 t s M e t h o d s ：T l l b u l o i n t e r s t i t i a lf i b r o s i sr a tm o d e lW a se s t a b l i s h e db yu n i l a t e r a lu r e t e r a lo b s t r u c t i o nf u u o ) 4 8S p r a g u e D a w l e y m a l em r sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot w og r o u p s ：m o d e lg r o u p

8、= 2 4 ) a n ds h a m - o p e r a t e dg r o u p ( n = 2 4 ) 8r a t sw e r eo b t a i n e d a td a y7 1 4a n d2lo ft h ee x p e r i m e n t H i s t o l o g i c a lc h a n g e sw e r eo b s e r v e di nt u b u l o i n t e r s t i t i u mi n i u r yu n d e rm i c r o s c o p e I m m u n o h i s t e c h

9、 e m i c a lm e t h o dW a Sp e r f o r m e dt o i n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no f0 P Na n dC D 4 4i nT I F a n dt h ee f f e c to f G u i z h i f u l i n gC a p s u l e so nt h ee x p r e s s i o no fO P Na n dC D 4 4 R e s u l t s ：R e n a lt u b u l o i n t e m t i t i u mi j u r y

10、a g g r a v a t e di n c r e a s i n g - l ya tt h et h r e et i m ep o i n t s I m m u n o h i s t o c h e m i s t r yr e s u l t ss h o w e dt h a t0 P Na n dC D 4 4p r e s e n t e dh i s he x p r e s s i o ni nT I F a n dt h e ye x p r e s s e di n c r e a s i n g l yw i t ht h ed e v e l o p m e

11、 n to fT I F T h ee x p r e s s i o no f0 P Na n dC D 4 4i nT I Fp r e s e n t e dp o s i t i v e c o r r e l a t i o nw i t ht h ed e g r e eo fr e n a lt u b u l o i n t e r s t i t i u mi n j u r y ( 声0 7 8 2 。P 0 0 1 ；r = O 7 7 4 。P 0 o o C o n c l u s i o n ：T h ee x p r e s s i o no f0 P Na n

12、dC D 4 4o b v i o u s l yi n c r e a s e 8i nt h eI o e a l i t yo fo b s t r u c t i v en e p h r o p a t h y T h ee x p r e s s i o no f0 P Na n dC D 4 4i s i n c r e a s e di nt h et u b u l o i n t e r s t i t i u mi n i u r ya n dm e d i a t e st h em o n o n u c l e a rc e l li n f i h r a t i

13、 o na sw e l l 鹊t h ed e v e l o p m e n to fT I F K e yw o r d s T u b u l o i n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ；O s t e o p o n t i n ；C D 4 4 肾小管间质纤维化( t u b u l o i n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ，T I F ) 是几乎 所有肾脏疾病进展到终末期肾病过程中肾损伤的共同病理 特征。T I F 的发生机制涉及许多细胞因子和化学因子的参与。 近年研究显示，骨调素( o s t e

14、 o p o n t i n ，O P N ) 作为一种分泌性糖 蛋白，与其配体C D 4 4 在肾损伤中表达上调，并介导肾间质 巨噬细胞浸润和间质纤维化的发展。二者相互作用参与肾脏 的发病过程1 1 1 。本文通过研究O P N 和C D 4 4 在梗阻性肾病大鼠 中的表达来探讨其在肾小管问质纤维化病变过程中的作用。 1 材料与方法 1 1 实验动物 3 月龄健康雄性S D 大鼠4 8 只( 由河南医科大学动物实 验中心提供) ，体重1 6 0 2 1 0g ，分笼饲养，自由饮食。多克隆 【作者简介】张连云( 1 9 7 5 一) ，女，主治医师，硕士，从事肾脏病及风湿病的 临床与研究工作。

15、 兔抗大鼠O P N 抗体和兔抗大鼠标准C D 4 4 抗体均购自武汉 博士德生物工程有限公司。 1 2 单侧榆尿管梗阻( u u o ) 大鼠模型的建立 按照参考文献翻，氯胺酮( 5 0m g l 【g ) 腹腔注射麻醉S D 大 鼠，大鼠背部左肋下备皮，常规消毒，沿腋后线从左肋下向尾 部方向剪开皮肤钝性分离皮下组织及肌层，暴露左肾。沿肾 蒂向肾下极方向寻找输尿管，在输尿管上段行双线结扎，在 两结扎点之间剪断输尿管。逐层缝合皮下组织及皮肤。假手 术组大鼠除不结扎、离断输尿管外，步骤同上。 1 3 动物分组 各组分别于手术后第7 、1 4 、2 l 天分别收获8 只大鼠，进 行组织学、免疫学方

16、面的检测和评价。 1 4 肾脏病理 各组在实验第7 、1 4 、2 1 天分别处死实验大鼠各8 只。取 C H I N AM E D I C A LH E R A L D 巾目层蜀导簟19 万方数据 论著 右肾组织块及时以1 0 多聚甲醛溶液固定2 4h ，常规梯度酒 精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，3 斗m 切片，进行苏木素一 伊红( H E ) 染色和M a s s o n 染色。光镜下对肾小管间质病变进行 半定量评分离。组织学评价由2 名观察者采用双盲法独立完成。 1 5 免疫组化 常规以1 0 多聚甲醛溶液固定肾组织梯度酒精脱水二 甲苯透明，石蜡包埋，4 斗m 切片。常规石蜡切片脱

17、蜡至水。采 用链霉亲和素一生物素一过氧化物酶法( S A B C 法) 对多克隆 O P N ( 1 ：1 0 0 ) 和C D 4 4 ( 1 ：1 0 0 ) 进行染色，O P N 和C D 4 4 染色结 果在高倍镜( 2 0 0 ) 下随机选择2 0 个不重叠的视野，采用半 定量评分【划，由2 名观察者采用双盲法独立进行评价。 1 6 统计学处理 数据以均数标准差( 孟虹) 表示，应用S P S S1 2 0 软件进行 两组独立样本的t 检验( 双侧) 及二元变量的非参数S p e a r m a n 等 级相关性检验。P 0 0 5 表示有显著性差异。 2 结果 2 1 肾组织病理学

18、改变 各时期假手术组无明显病理改变。模型组随时间延长 梗阻侧肾间质纤维化逐渐形成并进展，而肾小球改变不明 显。模型组大鼠7d 时，可见。肾间质炎症细胞浸润上皮细胞 肿胀、变性，肾小管轻微扩张，肾间质增宽；1 4d 时肾间质炎 症细胞浸润较多，局灶性加重，小管上皮细胞肿胀、变性、坏 死，可见脱落的上皮细胞肾小管明显扩张肾问质明显增 宽。纤维化明显：2 1d 时梗阻件肾病大鼠主要表现为大部分 肾小管萎缩或消失。肾间质纤维化程度进一步加重。肾小球 可见轻度系膜增生。肾小球肥大。假手术组大鼠各时相点小 管间质纤维化程度均较模型组轻。见表l 。 壅! 鱼堕塑塞堕望查塾堕型：笪塑星塑宣塑堕l 玉兰2 分组

19、n 时l 印 7d1 4d2 1d 与同时相点假手术组比较，8 P 0 0 1 ；与7d 比较。b p 0 O l 2 2 免疫组化结果 2 2 1O P N 的表达假手术组：O P N 在远端小管上皮少量表 达，肾小球和近端小管则表达不明显。模型组：实验第7 天即 可发现O P N 在皮质损伤肾小管中表达升高。在1 4 、2 1d 时 O P N 表达持续上调，与假手术组同一时相点比较。均有显著 性差异( 均P 0 0 1 ) 。见表2 和图1 、2 。 墨兰鱼堕塑盛堕塑查垦竖壁Q 丝塞姿! 生望2 分组n 时间 7d 1 4d2 1d 与同时相点假手术组比较I P 0 0 1 2 2 2C

20、 D 4 4 的表达假手术组：壁层上皮细胞、髓质小管和皮 质小管( 升支粗段和远端小管) 町以检测到C D 4 4 表达。模型 组：各个时间点皮质小管C D 4 4 表达均有持续增高趋势。主 2 0 由自爱琢皇一C H l N AM ED I C A lH E R A L D 2 0 0 9 年1 0 月第6 卷第3 0 期 图1 实验7d 时模型组O P N 在损伤肾小管上皮中表达 增多伴间质炎症细胞浸润 ( S A B C ，x 2 0 0 ) 图2 实验1 4d 时模型组肾小管O P N 表达进一步增多。 伴小管间质损伤程度进一步加重 ( S A B C ，x 2 0 0 ) 要表达在损

21、伤远端和近端小管上皮，与假手术组比较，均有 显著性差异( 均P 0 0 1 ) 。见表3 。 表3 各时相点两组大鼠肾脏C D 4 4 表达( 牙虹) 与同时相点假手术组比较段O 0 1 2 3 相关性分析 O P N 和C D 4 4 在1 I F 的发生及发展过程中的表达与小管 间质损伤程度均呈正相关( 卸7 8 2 ，P 0 0 1 ；r - - 0 7 7 4 ，P 0 0 1 ) 。 3 讨论 O P N 是一类含有A r g G l y A s p 结合序列和凝血酶裂解 位点。具有磷酸化和非磷酸化两种形式的分泌性糖蛋白。O P N 包括C D 4 4 和整合索两个受体家族，并通过不

22、同受体发挥多 种生物学功能。既往研究显示，在嘌呤霉素肾炎、抗T h y 一1 肾 炎、被动H e y m a n n 肾炎等实验性肾小球肾炎动物模型中。 O P Nm R N A 和蛋白在部分近端和远端小管上的表达上调且 O P N 表达与单核一巨噬细胞集聚于小管损伤位置相关i s - 6 l 。本 实验中，笔者利用U U O 致肾小管间质纤维化大鼠模型。分别 万方数据 2 0 0 9 年l O 月第6 卷第3 0 期 在梗阻第7 、1 4 、2 1 天动态观察了O P N 在梗阻性肾病组织中 的表达和分布情况。结果发现，O P N 蛋自在正常肾组织远端 小管上皮、集合管中有少量表达，且髓质部

23、分高于皮质，肾小 球未见O P N 表达。实验第1 周梗阻性肾病大鼠O P N 蛋白即 有高表达，主要分布在损伤肾小管( 包括近端小管和远端小 管) 上皮；实验第1 4 天，上述部位O P N 蛋白表达持续升高， 而第2 l 天时O P N 表达面积有所下降增宽的问质纤维化区 域和坏死肾小管没有明显的O P N 表达。从梗阻性肾病大鼠 病理组织学角度观察。O P N 的高表达主要与小管间质炎症细 胞浸润程度和肾小管损伤程度直接相关。说明O P N 通过促 进小管间质炎症细胞浸润直接参与肾小管间质损伤及纤维 化的发病过程。以上结果支持既往文献报道闻。同时有学者 发现，在人类f g A 肾病、弥漫

24、增殖性狼疮肾炎远端和近端小 管上皮细胞胞质中的O P N 表达上调上调的O P N 同肾问质 单核细胞浸润呈正相关。C D 6 8 + 单核细胞浸润与小管O P N 表 达密切相关。由此可知，研究O P N 在多种原因引起的肾损伤 过程中的表达及可能作用对于治疗和预防T I F 的发生及发 展具有重要意义。 本实验结果发现作为O P N 的一个配体，C D 4 4 在小管 间质纤维化发展过程中的近端小管、远端小管、集合管中的 表达升高并与小管损伤和间质纤维化程度的加重密切相关。 有学者发现，C D 4 4 部分通过增强H G F 和T G F B l 信号转导 促进纤维生成1 9 1 。O P

25、 N 和C D 4 4 在肾小管间质损伤中的表达 上调二者叮能共同通过介导炎症细胞浸润和其他促纤维生 成因子参与，r I F 的发病过程，因此十预O P N 和C D 4 4 的表 达有可能达到延缓1 I F 进展的同的。既往研究证实，抗O P N 处 理显著抑制O P N 和C D 4 4 的表达旧。由此可知。0 P N 和C D 4 4 受体相互作用共同参与肾脏损害后的修复和炎症过程。 由于，1 1 F 的发生和发展过程涉及多种细胞因子、化学因 子或毒性分子等多种因素的参与，导致间质浸润、小管细胞 损伤、肌成纤维细胞积聚以致肾脏纤维化。所以。，1 1 F 的发病 机制尚不明确。就O P N

26、 和C D 4 4 共同参与肾脏损伤的发病 过程这一点。目前仍有不同的看法。有学在G o o d p a s t u r e 综合 征I l l I 、急进性肾小球肾炎【I l I 、l g A 肾病1 1 2 1 中未发现O P N 表达与 肾脏损伤病理改变、肾小球新月体形成、毛细血管内血栓形 成有直接相关性证据。 本研究结果表明，O P N 和C D 4 4 在T I F 中呈高表达，且 随着T I F 的进展不断升高。O P N 和C D 4 4 在，兀F 中的表达同 论著 小管间质损伤程度呈正相关。因此可以试图应用某些药物 通过降低O P N 及C D 4 4 的表达。进而减轻炎症细胞

27、浸润。改 善肾脏组织病理损伤，延缓肾脏纤维化进展。从而起到肾保 护作用。 【参考文献】 【1 】X i eY ，N i s l dS ，I g u e h iS ，e ta 1 E x p r e s s i o no fo s t e o p o n t i ni ng e n t a m l c i n - i n d u c e d a c u t e t u b u l a r n e c r o s i s a n d i t s r e c o v e r y p r o c e s s 田K i d n e y I n t , 2 0 0 1 , 5 9 ( 3 ) ：9 5 9

28、 - 9 7 4 【2 】S o m m e rM 。S c h a l l e rR ，F u n f s t u e kR ，e ta 1 A b n o r m a lg m w t l la n dd o n a l p r o l i f e r a t i o no ff i b r o b l a s t si nf i na n i m a lm o d e lo fu n i l a t e r a lu r e t e r a lo h - s t r u c t i o n 【J 】N e p h r o n ，1 9 9 9 ，8 2 ( 1 ) ：3 9 - 5 0

29、【3 】3 B a d i dC ，V i n c e n tM M c G r e g o rB ，e ta 1 M y c o p h e n o l a t em o f e t i lr e d u c e s m a e f i b m b o a s ti n f i l t r a t i o na n dc o l l a g e n d e p o s i t i o ni nr a tr e m n a n t 【J 】 K i d n e yI n t ，2 0 0 0 ，5 8 ( 1 ) ：5 1 - 6 1 【4 】D a v i e sJ A 。F i s h e

30、 rC E G e n e sa n dp r o t e i n si nr e n a ld e v e l o p m e n t1 1 1 E x p N e p h r o i ，2 0 0 2 ，1 0 ( 2 ) ：1 0 2 - 1 0 3 【5 1P i c h h r 民G i a c h e l l iC M ，L o m b a r d iD ，e ta 1 T u b u l o i n t e r s t i t i a ld i s e a s ei n g l o m e r u l o n e p h r i t i s P o t e n t i t a l

31、r o l e o f o s t e o p o n t i n ( u w p o n 6 n ) 【| lA m JP a h o k 1 9 9 4 , 1 4 4 ：9 1 5 9 2 6 【6 】M a g i lA B ，P i c h l e rR H ，J o h n s o nP d O s t e o p o n t i ni nc h r o n i cp u r o m y c i n a m i n o n u c l e o s i d en e p h r o s i s 1 1 JA mS o cN e p h r o ，1 9 9 7 ，8 ( 1 8 )

32、：1 3 8 3 - 1 3 9 0 【7 】K a n e i oH ，M o r r i s s e yJ ，M cC r a c k e nR e ta 1 O s t e o p o n t i ne x p r e s s i o ni n t h ek i d n e yd u r i n gu n i l a t e r a l u r e t e r a lo b s t r u c t i o n 【J 】M i n e rE l e c t r o l y t e ，+ M e t a k l 9 9 8 2 4 ( 4 ) ：2 2 7 - 2 3 7 【8 】R o u

33、 s c h o pK M ，S e w n a t hM E ，C l a e s s e nN ，e ta 1 C D 4 4d e f i c i e n c yi n c r e a s - e st u b u l a rd a m a g eb u tr e d u c e sr e n a lf i b r o s i si no b s t r u c t i v en e p h r o p a t h y 叨JA mS o cN e p h r o l , 2 0 0 4 ，1 5 ( 3 ) ：6 7 4 - 6 8 6 【9 】Y uX Q ，N i k o l i e

34、 - P a i e r s o nD J M UW ，e t8 1 Af u n c t i o n a lr o l ef o ro s t e o - p o n t i ni ne x p e r i m e n t a lc r e s c e n t i cg l o m e r u l o n e p h r i f i si nt h er a t 忉P r o e A s s o cA mp h y s i c i a n s , i 9 9 8 ，I1 0 ：5 0 - - 6 4 【1 0 】O k a d aH 。M o r i w a k iK K a l l u r

35、 lR e ta 1 O s t e o p o n t i ne x p r e s s e db yr e n a l t u b u l a re p i t h e l i u mm e d i a t e si n t e r s t i t i a lm o n o e y t ei n f i l t r a t i o ni nr a t s 明 A mJP h y s i o lR e n a lP h y s i o l ，2 0 0 0 ，2 7 8 ( 1 ) ：F 11 0 - 1 2 1 11 1B o n v i l l iJ M ，S c l m t n n a

36、 r mU ，B e c k S e h i m m e rB ，e ta 1 L a c ko f 讯v i v o f u n c t i o no fo s t e o p o n t i ni ne x p e r i m e n t a la n t i - G B Mn e p h r i t i s B - JA mS o e N e p h r o l , 2 0 0 0 , 11 ( 9 ) ：1 6 4 7 1 6 5 5 【1 2 】K a i m o r iJ Y ，T a k e n a k aM ，N a g a n w aY ，e ta 1 Q u a n t i

37、 t a t i v ea n a l y s e so f o s t e o p o n t i nm R N Ae x p r e s s i o ni nh u m a np r o x i m a lt u b u l e si s o l a t e df r o m r e n a lb i o p s yt i s s u es e c t i o n so fm i n i m a lc h a n g en e p h r o t i cs y n d r o m ea n d t s Ag l o m e r u l o n e p h r o p a t h yp a t i e n t s 叽A mJK i d n e yD i s , 2 0 0 2 , 3 9 ( 5 ) ) ) ) ：9 4 8 9 5 7 ( 收稿日期：2 0 0 9 - 0 6 - 1 9 ) C H I N AM E D I C A LH E R A L D 巾国层药导鬟2 1 万方数据