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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 1 8 2 . 1 -2 0 0 3 禽流感抗体检测方法 琼脂免疫扩散试验 D e t e c t i o n a n t i b o d i e s a g a i n s t a v i a n i n f l u e n z a v i r u s - P r o c o t o l o f a g a r g e l i mm u n o - d i f f u s i o n t e s t 2 0 0 3 - 0 3 - 1 7发布2 0 0 3 - 0 9 - 0 1 实施 中华人民共和国 国家 质 量 监 督 检 验 检
2、疫 总 局 发 布 S N / T 1 1 8 2 . 1 -2 0 0 3 前言 本标准根据OI E / C h a p t e r 2 . 1 . 1 4 , 4 t h e d i t i o n , 2 0 0 0 , 诊断方法和疫苗标准手册) ( Ma n u a l o f s t a n d - a r d s f o r d i a g n o s t ic t e s t s a n d v a c c in e s ) 起草 本标准的附录 A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国珠海出人境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人
3、: 潘文波、 薛景山、 徐海聂、 廖秀云。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N/ T 1 1 8 2 . 1 -2 0 0 3 禽流感抗体检测方法琼脂免疫扩散试验 范 围 本标准规定了禽流感琼脂免疫扩散试验操作规程。 本标准适用于检测禽类血清中是否含有禽流感( A I ) 病毒抗体。主要适用于禽类禽流感检疫、 疫情 监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注
4、日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格及试验方法 原 理 抗原和抗体的分子量一般都在2 0 万道尔顿以下， 抗原及其特异性抗体在凝胶中从高浓度区域向低 浓度区域扩散时所受阻力很小， 基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、 结构、 形状和电 荷量不同， 因此其扩散系数不同， 在凝胶中的扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中 相遇， 形成抗原抗体复合物， 若两者在相遇处比例适当， 则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增 大， 颗粒增大， 因而不再继续扩散而产生沉淀， 呈现出线状或带状， 其形成的线状或
5、带状被称为免疫沉淀 线或免疫沉淀带， 因此， 可根据抗原与被检血清之间是否出现沉淀线来判定被检血清中是否存在特异性 抗体 。 4 材 料准 备 4 . 1 试剂: 磷酸二氢钠( N a H , P O ,， 2 H, O) , 磷酸氢二钠( N a , HP O ., 1 2 H O) , 氯化钠( N a C L ) , 叠氮 钠， 琼脂糖， 均为分析纯。 4 . 2 琼脂扩散试验抗原、 标准阳性血清: 由指定单位供应。按说明书使用 4 . 3 器材: 吸管、 量筒、 平皿( 规格为 9 0 mm X1 5 m m) 、 三角瓶、 外径约 5 m m金属打孔器、 微量移液器 和微量吸头、 观
6、察灯等。 4 . 4 被检血清: 按常规方法采血分离血清。应无溶血， 无细菌污染。保存于4 C . 5操作方 法 51 试验 用水 本标准所用水应符合GB / T 6 6 8 2 -1 9 9 2中三级水( 三蒸水) 的规格要求。 5 . 2 琼脂板的制备 5 . 2 . 1 琼脂溶液的配制参见附录A. 5 . 2 . 2 制板 待琼脂溶液自然冷却至约5 6 时， 将直径为9 0 m m洁净灭菌的平皿置于水平平台上， 每 个平皿加 1 5 m L ， 使凝胶厚度达 2 mm-3 mm， 加盖平皿盖， 待自然冷却凝固后. 将平皿倒置湿盒中， 4 0C S N/ T 1 1 8 2 . 1 -2
7、0 0 3 冰箱密封备用。 5 . 3 打孔 反应孔现用现打。从冰箱内取出琼脂板， 按图 1 或图2 打孔， 孔径约 5 mm， 孔距2 m m-5 mm。将 孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出， 勿伤边缘， 以免渗漏。加热封底( 一次性树脂平皿除外) 。 户。 图1 图 2 5 . 4加样 用微量移液器吸取抗原悬液加人孔， 阳性对照分别加入孔中， 受检血清按顺序分别加人其余各 孔中， 每孔均以加满不溢出为度。每加一个样品应换一个滴头 5 . 5反应 加样完毕后， 静止 1 0 mi n ， 将平皿倒置， 放人湿盒于室温 2 2 0C -2 5 下培育 4 8 h -7 2 h ， 分别在 2 4
8、 h , 4 8 h , 7 2 h 观察并记录结果。 结果判定 6 . 1 将琼脂板置黑色背景下观察 标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线， 则试 验成立， 否则视为无效， 需重复该试验。 6 . 2 若被检血清孔与中心抗原之间出现沉淀线， 并与标准阳性血清的沉淀线末端平滑相连接( 如图1 所示 1 号孔 ) ， 则被检血清判为阳性 6 . 3 被检血清与中心抗原孔之间虽不出现沉淀线， 但标准阳性血清的沉淀线一端弯向被检血清孔( 如 图 1 所示 3 号孔) ， 则此孔的被检样品判为弱阳性( 凡弱阳性者应重复试验一次) 6 . 4 如被检血清孔与中心抗原孔之间不出现沉淀线且标
9、准阳性血清沉淀线直向被检血清孔或向其外 侧偏弯者( 如图 1 所示 2 号孔) ， 则被检血清判为阴性。 6 . 5 被检血清孔与中心抗原孔之间沉淀线与标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉( 如图 1 所示 4 号孔) ， 则判为非特异性反应， 应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性 S N/ T 1 1 8 2 . 附录A ( 资料性 附录 ) 琼脂溶液的配方 A . 1 P H 7 . 2 0 . 0 1 m o l / L P B的制备 甲液: 磷酸二氢钠( N a H 2 P O , 2 H, O ) 1 . 5 6 g 水1 0 0 0 mL 乙 液: 磷酸氢二 钠( N a , H P O , 1 2 H 2 0 ) 3 . 5 8 5 g 水1 0 0 0 mL 待甲乙二液充分溶解后， 分别保存， 用时取甲液 2 8 mL ， 乙液7 2 m L混合即成。 A. 2琼脂溶液的制备 琼脂糖0 . 99 氯化钠( N a C D 8 . 0 g 叠氮钠。 1 9 用 p H7 . 2 0 . 0 1 m o l / L P B定溶至1 0 0 mL ， 高压 1 0 5 KP a 1 5 m i n或 1 0 0 水浴煮沸至完全溶解。