SN-T 1271-2003 栎枯萎病毒检疫鉴定方法.pdf.pdf

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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 2 7 1 -2 0 0 3 栋枯萎病菌检疫鉴定方法 I n s p e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f C e r a t o c y s t i s f a g a c e a r u m ( B r e t z ) H u n t 2 0 0 3 - 0 5 - 2 8 发布2 0 0 3 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和匡 国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 S N / T 1 2 71 -2 0 0 3 前言 本标准的附录C和附录 E为规

2、范性附录， 附录A、 附录 B和附录 D为资料性附录. 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负贵起草单位: 国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所。 本标准主要起草人: 严进、 吴品珊。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准. S N/ T 1 2 7 1 -2 0 0 3 栋枯萎病菌检疫鉴定方法 1 范圈 本标准确立了人境栋属( Q u e r c u s L) 植物和其他栋枯萎病菌寄主， 包括原木、 木制品( 含木质包装 ( 铺垫材料)和苗木的栋枯萎病菌检疫检测和鉴定方法。 本标准适用于对来自栋枯萎病发生国家和地区( 参见附录A) 的所有栋属植物和栋枯姜病菌其他寄 主的人

3、境检疫. 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准. 2 . 1 传播介体m e d i u m 对于侵染性病害的病原体起转移作用并创造侵人条件的生物， 如昆虫、 线虫等. 2 . 2 边 材 s a p w o o d 树皮下较软的白木质。 2 . 3 异宗配合h e t e ro t h a l i s m 菌体在性的配合上有雌雄和( 或) 亲和力的分化， 只有一定的异宗菌体( 一般以+和一或 A : 和 A , 加 以区别) 才能配合 。 原理 3 . 1 分类地位 栋枯萎病菌 C e r a t o c y s t i s f a g a c e a r u m ( B r e t z

4、) H u n t 属真菌界( F u n g i ) ， 子囊菌门( A s c o my c o t a ) , 核菌纲( P y r e n o m y c e t e s ) ， 球壳 目( S p h a e r i a l e s ) ， 长咏壳科( O p h io s t o m a t a c e a e ) ， 长味壳属( C e r a t o c y s t i s E l l . 衣H a l s t . ) 。 3 . 2寄主 栋属Q u e r c u s L、 栗属C a s t a n e a Mi l l 、 锥属C a s t a n o p s i s

5、S p a c h 和石栋属L i t h o c a r p u s B I . 的全部种。 栋枯萎病菌 可以 通过寄主原木、 木制品和 苗木或其上所携带的传播介体在国际上传播。 3 . 3 鉴定原理 栋枯萎病菌的寄主范围、 传播途径、 造成的植株症状( 见附录D图D . 4 ) 和病原形态( 见附录D图 D . 1 , 图D . 2 、 图D . 3 ) 是 栋枯萎 病菌检 疫鉴定方法的 依据。 仪器设备和实验用具 4 . 1 仪器设备 立体显微镜、 生物显微镜( 具油镜和测微尺) 、 电子分析天平( 感量0 . 0 0 1 g ) 、 普 通天平( 感量0 . 1 g ) , 超净工作台

6、、 生物培养箱、 高压灭菌器. 4 . 2 试验用具 斧子、 锯子、 手持 放大镜、 培养 皿、 三角瓶( 5 0 0 m L 、 试管( 直径1 2 m m ) 、 烧杯( 1 0 0 0 rn L ) 、 手术刀、 手 术剪、 镊子、 载玻片、 盖玻片、 量筒、 吸管、 酒精灯. S N/ T 1 2 7 1 -2 0 0 3 5 试剂和标准菌株 5 . 1 试剂 葡萄 糖( C 5 H , O s H z 0 ) 、 甲( 苯) 丙氨 酸、 磷酸二氢钾( K H z P O ; 含量不少于9 9 . 0 %) , 硫酸镁( M g - S 0. 7 H= O含量不少于 9 9 . 0 %

7、) , 硫酸铁 F e z ( S O , ) , x H, O含量( 以 F e 计) 2 1 . 0 - 2 3 . 0 % , 硫酸锰 ( Mn S O ; 含量不少于9 9 . 0 %) , 硫酸锌( Z n S O , 7 H 2 0含量不少于9 9 . 0 %) 、 维生素 H( V i t a m i n H) 、 琼 脂粉 。 5 . 2 标准菌株， ， C e r a t o c y s t i s f a g a c e a r u m ( B r e t z ) H u n t A , 和A : 标准 菌株。 抽样 按货物总件数 。 . 5 % - 5 %抽查， 5 0

8、0件以下抽查3件5 件， 5 0 1件1 0 0 0件抽查 6件1 0 件， 1 0 0 1 件3 0 0 0件抽查 1 1 件2 0件， 3 0 0 1 件上， 每增加 5 0 0 件抽查件数增加 1 件. 7 检 验方法 7 . 1 现场检验 将抽取的原木或木制品或苗木用斧子或锯子分别横向和纵向切开， 仔细观察横断面和纵断面有无 黑褐色条纹( 参见附录 D ) 。如带皮， 则要检查树皮和木质部之间是否有垫状菌丝层和边材上是否有传 病媒体( 参见附录 B ) , 标本带回实验室作进一步检验。 7 . 2 实验室检验 7 . 2 . 1 分离培养 采用麦芽浸出液酵母培养基或 N F P培养基(

9、 参见附录 C ) ， 用于病原菌的分离、 培养形状测定和菌 种保存。 在褐色条纹处取一块组织， 切成4 mmX4 m m的小片， 用 。 . 5 写 N a O C I 表面灭菌 5 m i n ， 无菌水冲 洗三遍， 放在直径 9 c m的平板培养基上， 每皿放 4 片6 片， 于 2 4 0C培养箱内培养， 黑暗和光照( 3 2 0 mm -4 0 0 n m) 各1 2 h 交替。7 d后用显微镜检查. 若发现传病媒介昆虫， 则须检查是否携带栋枯萎病菌。首先进行昆虫形态鉴定. 再将其肢解， 组织 片用上述方法分离培养。 7 . 2 . 2 形态观察 从菌落中挑取少量培养物， 以水作浮载

10、剂， 制成玻片， 在显微镜下观察。 如为C e r a t o c y s t i s f a - g a c e a r u m的无 性阶段， 即可观察到分生抱子梗和分生抱子。 详细记录并测量分生抱子梗和分生抱子 大小 。 用直径 4 mm的打孔器取菌落边缘的菌块两块， 分别放在两个 NF P培养基平板的一侧; 用同法分 别取标准菌株C e r a t o r y s t i s f a g a c e a r u m A ， 和A 。 交配型的菌 块各一块， 分别放在上述平板培养基的另 一侧， 于2 4 下培养 7d -1 0d 。用立体显微镜观察同一平板培养基上的两菌落交界处是否产生子囊

11、 壳。挑取两菌落交界处产生的子囊壳制成玻片， 于显微镜下观察. 如与 A ; 交配型菌落交界处产生子囊壳， 则待测菌株为A : 交配型， 如与 A : 交配型菌落交界处产生 子囊壳， 则待测菌株为 A， 交配型。 测量子囊壳、 子囊和子囊抱子大小， 并作详细记录。 鉴定标准 1 ) 来自美国的C e r a t o c y n t i s f a g a c e a r u m( B r e t z ) Hu n t A , 和A， 标准菌株保存于动植物检疫实验所. S N/ T 1 2 7 1 -2 0 0 3 8 . 1 . 1 曹养体形态 菌落呈绒毛状， 厚 1 mm-3 mm， 初为白

12、色， 后为淡灰色至黄绿色， 常有褐色斑块。 菌丝分枝有横隔， 淡色至褐色， 宽 2 . 5 1, m - 6 p m， 菌落中还能形成菌核 菌核茶褐色至黑色， 质地疏 松， 形状不定， 直径可达 2 . 5 c m。此外， 还可形成一种橄榄色厚垣抱子。 8 . 1 . 2 无性挤殖器官形态 分 生抱子内生， 无色， 单胞， 圆筒形， 两 端平截， 大小为( 2 p m -4 . 5 F c m ) X ( 4 p m -2 2 p m ) ， 在培养 基上可 形成分生抱子链。 分生抱子梗分枝或不分枝， 宽2 . 5 p m - 5 p m ， 长2 0 p m - 6 0 p m, 淡色至黑色

13、， 有分隔， 顶端逐渐变尖( 参见附录D图D . 1 ) . 8 . 1 . 3 有性盈殖器官形态 子囊壳单生或丛生， 黑色， 瓶形， 基部球形， 直径 2 4 0 p m-3 8 0 p m. 几乎整个埋于基质内。子囊壳具 有长味， 咏长2 5 0 p m-4 5 0 p m, 顶端生有无色须状物( 参见附录 D图D . 2 ) 。子囊球形到近球形， 最大直 径 7 u m -1 0 p m， 内含八个子囊抱子。子囊抱子单胞， 无色， 椭圆形， 微弯， 大小为( 2 p m-3 p m) X ( 5 p m -1 0 p m ) ( 参见附录D图D . 3 ) 。子囊壁易消解， 成熟后， 子

14、囊抱子从孔口 流出， 聚集在白 色粘液中 呈小滴状， 在水中不易分散。 9结果判定 如症状和分离物的 各形态特征分别与描述的症状和病原菌形态相吻合， 即可鉴定为C e r a t o c y s t i s fa g a c e a r u m ( Br e t z ) Hu n t . 1 0 样品保存 1 0 . 1 菌种保存 分离到的C e r a t o c y s t i s f a g a c e a r u m菌种， 应 转人试管 斜面 上， 置于1 5 黑暗 条件下保存至 少1 2 个 月， 以备复验、 谈判和仲裁. 1 0 . 2 传病介体保存 捕获的传病昆虫除用于分离病原菌

15、外， 其余的应使其存活至检验鉴定完成， 然后制成标本。尽量保 持其身体各部位的完整性。 1 0 . 3 检验报告与资料保存 检验报告内 容包括: 样品来源、 种类、 数量、 实验日 期、 方法、 结果等， 并要有检验人员签字( 参见附录 E ) 。实验 原始 记录以 及标本和照片等资料需保存完整， 以 便需要时复验、 谈判和仲裁。 1 1 复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或专家负责。主要复核分离到的菌种和捕获到传病昆虫 鉴定的正确性， 实验原始记录、 标本和照片资料的完整性。 S N/ T 1 2 7 1 -2 0 0 3 附最A ( 资料性附最) 株枯典病宙C e r a t o

16、c y s t i s j a g a c e a r u m ( B re t z ) H u n t 世 界分布 A. 1 A. 2 欧洲 保加利亚、 波兰、 罗马尼亚。 北狡洲 美国( 阿肯色、 印地安纳、 伊利诺斯、 依阿华、 堪萨斯、 肯塔基、 马里兰、 密执安、 明尼苏达、 密苏里、 内 布拉斯加、 北卡罗莱纳、 南卡罗莱纳、 南达科他、 俄亥俄、 俄克拉荷马、 宾夕法尼亚、 田纳西、 得克萨斯、 弗 吉尼亚、 西弗吉尼亚、 威斯康星) . S N / T 1 2 71 -2 0 0 3 附录B ( 资料性附录) 栋枯婆病菌 C e r a t o c y s t i s f a

17、g a c e a r u m ( B ret z ) H u n t 传病媒介 B. 1 B. 2 B. 3 B 4 果实礴尾甲 属 C a r p o p h i l u s S t e p h e n s C . l u g u b r i s 旅尾 甲属Gl i s c h r o c h i l u s Re i f f e r G . s a n g u i n o l e n t u s G . q u a d r i s i g n a t u s G . f a s c i a t u s G. s i e p ma n n i 票额小盆属P s e u d o p i t

18、y o p h i h o r u s S w a i n e P. mi n u t i s s i mu s P . p r u i n o s i s 毛束小盘S c o l y t u s i n t r i c a t u s R a t z e b u r g S N/ T 1 2 7 1 -2 0 0 3 附录C ( 规范性附录) 培养甚配方 C . 1 C. 2 交芽没出液醉母培养基 麦芽浸 出液59 酵母19 琼脂粉2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL 先调酸度至p H 6 . 0 , 然后在1 5 1 b . 或1 2 1 下 灭菌1 5 m , N F P ， 培葬甚

19、葡萄搪 甲( 苯) 丙氨酸 磷酸二氢钾( K H2 P 0 4 ) 硫酸镁( Mg S 0 , ) 硫酸铁( F e e ( S 0 , ) 7 ) 硫酸锰( Mn S 0 , ) 硫酸锌( Z n s o , ) 维生素 H( V i t a m i n H) 琼脂粉 蒸馏水 3g 0 - 59 1g 0 . 59 0 . 2 g 0 . 2 g 0 . 2 g 5 p g 2 0 g 1 0 0 0 m L 在 1 5 1 b . 或 1 2 1 下灭菌 1 5 m, 2 ) N F P : 南京林业大学( 原南京林产工业学院) 森林病理教研组配方( 摘自 植物检疫 ( 浙江农业大学汇编)

20、 上 海科学技术出版社1 9 7 9 ) . S N/ T 1 2 7 1 -2 0 0 3 附录D ( 资料性 附录) 病原 菌形态示意 图和症状 图 D . 1 栋枯萎病菌分生抱子和分生抱子梗 图 D . 2 栋枯萎病菌子囊壳 S N/ T 1 2 71 -2 0 0 3 J; r 署 图 D . 3 栋枯萎病菌子.抱子 图 D . 4 栋枯婆病菌造成栋树边材上黑栩色条斑 S N / T 1 2 71 -2 0 0 3 附录E ( 规范性附录) 检疫鉴定报告单示例 样 品 报 验 号名 称品 种数 量 / 质 量 产 地审 批 号取样时间 抽出国家或地区 运翰线路及方式: 用 途 :计划种

21、植地区: 检疫要求: 鉴 定 结果 检 验 日期 : 检验员: 检验方法: 结 果 : 实验室主任: 日期:年月日 单位负责人: ( 盖 章 ) 日期:年月日 S N/ T 1 2 7 1 -2 0 0 3 参考文献 1 中华人民共和国动植物检疫局等 1 9 9 7 中国进境植物检疫有害生物选编中国农业出版社 2 林传光 1 9 8 1 植物学名词解释病理分册科学出版社 仁 3 浙江农业大学汇编 1 9 7 9 植物检疫上海科学技术出版社 4 B r e t z T . W. 1 9 5 2 T h e A s c i g e r o u s S t a g e o f t h e O a k

22、 Wi l t F u n g u s P h y t o p a t h o l o g y 4 2 : 4 3 5 - 4 3 7 5 H e n r y B . W. 1 9 4 4 C h a l a r a q u e r c i n a n , s p . , t h e c a u s e o f o a k w il t P h y t o p a t h o l o g y 3 4 “, 6 3 1 - 6 3 5 6 C A B I &E P P O 1 9 9 7 Q u a r a n t i n e P e s t s f o r E u r o p e ( 2 “

23、E d i t i o n ) C A B I n t e r n a t i o n a l 7 O E P P / E P P O 1 9 9 7 D a t a s h e e t s o n q u a r a n t i n e o r g a n i s m s N o . 6 C e r a t o c y s t i s f a g a c e a r u m B u l l e t i n OE P P/ EP P O Bu l l e t i n 9 ( 2 ) 8 I MI 1 9 9 3 D i s t r i b u t i o n Ma p s o f P l a

24、n t D is e a s e s N o . 2 5 4 ( e d i t i o n 4 ) C A B I n t e r n a t i o n a l 9 S p l a w a N . S e t a l . 1 9 8 5 B l u e s t a i n o f o a k s a p w o o d c a u s e d b y C e r a t o c y s t i s f a g a c e a r u m S p r a w o z d a - n i a Ko mi s j a T e c h n o l o g i i D r e wn a , P o

25、l a n d 1 0 R o s n e v B . e t a l . 1 9 8 2 , V a s c u l a r m y c o s i s d i s e a s e o f Q u e r c u s p e t r a e a i n t h e e a s t e r n S t a r a P l a n i n a m o u n t a i n s G o r s k o - S t o p a n s t v o . 3 8 : 8 , 5 0 - 5 4 1 1 H a r i n g P . e t a l . 1 9 8 2 Wi l t d i s e a s e o f s e s s i le o a k ( Q u e r c u s p e t r a e a L i e b . ) c a u s e d b y C e r a t o c y s t i s f a g a c e a r u m( Br e t z . ) Hu n t C o n t r i b u t i i- B o t a n i c e . , 7 7 - 8 5 1 0